脊髓損傷豬模型建立的一般過程

符策崗 曾 艷 趙紅衛 劉 揚 肖運祥 陳海丹

(三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院脊柱外科脊柱微創中心 脊柱醫學與創傷研究所，湖北 宜昌 443000)

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·綜 述·

脊髓損傷豬模型建立的一般過程

符策崗 曾 艷1趙紅衛 劉 揚 肖運祥 陳海丹

(三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院脊柱外科脊柱微創中心 脊柱醫學與創傷研究所，湖北 宜昌 443000)

脊髓損傷；豬模型

脊髓損傷(SCI)的發病率隨著現代交通和建筑事業的發展而逐年上升，給患者及患者家屬帶來極大的精神及經濟負擔。盡管對于SCI患者的臨床處理已經有一定提高且可采用多種手段限制繼發性損傷，但患者神經功能的恢復依舊有限，眾多患者依然長期伴隨神經功能不全或喪失。因此，科研工作者們嘗試從多方面找尋SCI治療的方式和方法，例如干細胞移植〔1〕、MicorRNA調節通路〔2〕、神經再生〔3〕、低溫〔4〕、電刺激〔5〕、改良手術術式〔6〕或者一些其他后期護理強化療法〔7〕等等。但無論是上述哪一項研究，一個合適的SCI動物模型是其中必不可少的關鍵環節。鼠因易于控制、均一性良好且經濟方便等原因，成為構建SCI首選的動物模型，但近年發現，豬相對于鼠在解剖、神經生物學、心血管、胃腸道和基因組等方面與人類更為相似〔8〕。值得一提的是，豬脊柱脊膜的厚度與人類相似，可被用于脊柱壓力承受方面的研究，也可用于腦脊液壓力方面的研究〔9～11〕。此外，豬的病理生理變化也與人類相似，可用于研究SCI引起的局部代謝性變化〔12,13〕，同時豬體型相對較大，便于實施脊髓手術，也便于長期觀察脊髓損傷后肢體功能的恢復情況而常被用于SCI手術以及影像學分析方面的研究〔14,15〕。因此，豬在構建SCI模型方面具有其獨特的優勢，同時豬相比于靈長類動物也更為經濟，均一性也較強，本文就SCI豬模型構建的一般過程做一簡要綜述。

1 SCI豬模型構建的一般過程

1.1 動物的選擇 大部分報道中選用體重15～20 kg雌性小型豬，病理生理狀況與人類相似，部分數據如下〔8～15〕：血液值：紅細胞數(6～7)×106cells/ml；血細胞比容30%～35%；血紅蛋白9～11 g/dl；網織紅細胞，2%～3%；白細胞數(16～17)×109/L；血小板數(300～400)×109/L；凝血酶時間25～30 s；凝血酶原時間11～12 s。血流動力學：平均收縮壓(140±15)mmHg；平均舒張壓(96±14)mmHg；心率(103±14)次/min；每日排尿量1.5～2 L；直腸體溫(38.9±2)℃。血漿生化指標：葡萄糖(101±2)mg/dl；總蛋白(4.5±3)g/dl；白蛋白(2.6±0.1)g/dl；肌酸酐(0.6±0.01)mg/dl；鈣離子(11.8±0.7)mg/dl；堿性磷酸酶(492±15)U/L。

1.2 麻醉 手術前禁食12 h，給予肌肉注射氯胺酮(35 mg/kg)、乙酰丙嗪(1.1 mg/kg)和阿托品(0.04 mg/kg)混合液鎮靜，麻醉實驗豬后行氣管插管，維持供氧和1%～3%異氟醚持續全身麻醉，麻醉完成后給實驗豬頭部和背部備皮。獸醫工作人員全程在旁監測麻醉程度，檢測內容：眼瞼和角膜反射、心跳和呼吸頻率、動脈血氧飽和度、直接/間接血壓，呼氣末二氧化碳分壓、肌張力以及對傷害性刺激的反應等。

1.3 固定 實驗豬以俯臥位安置于模仿脊柱外科手術臺制作的平臺上。將可調式吊具固定于動物的胸部和骨盆下放，保持下腹部自由懸掛，這樣做能最大限度地減少腹部和胸部的壓力以及術中有可能隨之而來的硬膜外靜脈出血。此外，平臺還可起脊柱手術外固定的作用〔16〕。此外，實驗豬應被安置在循環熱墊上以保持體溫，應行耳緣靜脈穿刺以保證手術過程中藥物的給予和必要的補液。最后，手術區域用酒精與氯或碘溶液消毒后鋪巾，整個過程中需保證充分的手術區域暴露。

1.4 椎板切除術 選定手術位點后，做10～15 cm的手術切口，剝離脊柱兩側的肌肉組織。充分暴露椎骨后，使用咬骨鉗移除棘突和椎板，充分暴露下部的脊髓。常選用的手術位點是C3～C5或L2～L4。

1.5 安置脊柱吊桿 脊柱吊桿的安置是脊髓注射(基因或細胞)治療的必要裝置。此項裝置由Riley等〔17〕在2011年成功研發并使用。

安全放置好的患者，在安裝固定桿的位點做1 cm的切口并在切口處蓋上薄板。使用兩個拉鉤拉住4個經皮切口位點，牽拉并充分暴露脊髓區域(行椎板切除區域)。

1.6 硬膜開口 使用Woodson(牙科工具)在硬膜上做一個2.5 cm的切口，暴露脊髓。使用4-0的尼龍縫線將硬膜縫于脊柱兩旁肌肉組織上。如有條件也可行外科手術前貼膜，以保證脊髓液不會流至手術巾內造成污染。此外，在人類的手術中，軟膜表面應在外殼顯微鏡放大的條件下進行分離。

1.7 脊柱脊髓注射以及脊柱旁側路注射 在給藥前，靜脈注射甲潑尼松龍(125 mg)以防止脊髓腫脹。

將平臺上的軌制和側軌系統調節到適合的長度，在吊桿的上方，將2個桿子和Z字形驅動器裝在通用接頭上。將金屬管道安裝到微型硬盤內，將連接管連接到微量注射器上，調整通用接頭的方向并確保金屬管道垂直于脊髓注射的表面。將針定位于背跟刺入區(DREZ)。DREZ通過3.5×外科手術放大鏡定位，定位后將針從脊髓正中刺入<1 mm的深度。

液體可以注入軟脊膜約4 mm的深度，可在進針前放置一個塑料護翼在軟脊膜的表面，以防止入針過深。到達目標位置后可將金屬套管拔出，露出內部的管道。注射完成后，針需要留置約1 min，以防止細胞順著入針軌跡流出。

穿刺時盡量避開表面的血管系統，但穿刺位點的少許出血在所難免。一旦發生出血，應立即使用微型吸引器吸取干凈，盡力防止血液順穿刺位點流入脊髓內。如確定不會流入脊髓，也可以燒灼促使血液凝固。

隨著針管拔出，立體定向儀應當順著尾椎的方向遷移至下一個位點，兩位點之間相隔2～4 mm并避開背部表面可見的血管，這個過程根據實驗需要可以重復多次。

1.8 懸掛的注射導管 常常使用小直徑的金屬導管注射藥物。將一個30號的可調式柔性硅橡膠管套上一個長度固定的30號金屬套管斜針中，末端裝有泵漢密爾頓魯爾鎖并與微量注射器連接。近端的硅橡膠管用24號鋼性金屬管道包裹，放于注射器邊緣的尾部。翼樣的結構都被安在金屬管道的外部，發揮停針指示作用。每一次注射，實驗用藥都以適當的量通過微量注射泵注射。

1.9 縫合 一旦注射完成則移開脊柱吊架并分四層縫合切口。使用4-0號的尼龍線縫合硬脊膜，0號可吸收式線密閉縫合肌肉層。筋膜層依然使用0號可吸收式線密閉縫合，然后使用2-0號可吸收線縫合以連續縫合最外層，最后使用3-0尼龍線縫合皮膚。

1.10 術后恢復和疼痛控制 實驗豬在完成手術后應監控2 h，觀察麻醉后恢復情況。隨后將動物送回自己的籠中，每天觀察動物的攝食量，排便和排尿情況。

術后3 d，可用芬太尼貼劑(75 mg)局部貼覆手術區域，幫助緩解術后疼痛或用丁丙諾啡(0.05 mg/kg)肌注幫助緩解緩解術后疼痛。

1.11 癥狀和結果 在手術前記錄實驗豬的基本情況，術后再按實驗要求觀察1～7 w，收集行為數據并做神經病學分析〔18〕。采用機械性刺激腳趾或者后肢觀察無收縮反應是否缺失以判定感覺系統的功能情況。使用塔洛夫評分標準，判斷運動功能，評分等級如下0：麻痹，無運動；1：可觀察到肌緊張，輕微移動；2：可以移動后肢但是不能坐和移動；3：能做短暫的站立和行走但是存在共濟失調；4：完全恢復，具備正常步態。

操作的安全性由實驗豬術后機體功能是否能恢復到術前的基線決定。短暫性神經性功能缺失在手術后1～7 d內基本恢復，這一過程與動物的品種和手術操作有關(注射的次數或其他參數)，永久性神經功能缺失不能隨時間的推移而恢復。

2 前景展望

SCI模型在SCI相關研究中扮演重要的角色，準確的選擇良好的動物模型對實驗具有重要的指導意義。豬在病理生理、解剖、心血管、神經病學等等方面和人類有明顯的相似之處。豬模型運用于SCI研究有自己的特點和優勢，尤其在了解脊髓實質性注射的耐受力，對脊柱相關脫髓鞘、退行性變以及外傷性脊柱疾病實驗的設計和實行具有獨特的優勢。此外，有些實驗室在脊髓損傷方面已經做了很長期的研究，前期用的都是小鼠模型，但是近年轉而使用豬模型。在老鼠身上得到研究成果，在轉向人體之前，都需要在更高級的哺乳動物身上做進一步實驗，嚙齒類動物的神經系統相對比較簡單，我們需要更高級的實驗動物以獲得更為準確的實驗數據〔15〕。但是豬模型構建到目前為止依然不清楚能引起短暫性或永久性神經功能缺失的最大注射劑量，同時注射的位置也會影響發病率。此外，脊髓宏觀的(如不經意地轉動)或微觀的(如心臟搏動的震動)無意識運動有可能在脊髓注射時造成風險。了解大型實驗動物發病率的閾值，將有助于所有脊髓治療方案劑量的計算。本文闡述的脊髓模型構建方式希望能在脊髓模型應用設計和實驗上發揮一定作用。

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〔2016-02-19修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金(No.81302346)；宜昌市科技研究基金(A12301-06)；宜昌市中心人民醫院基金(KFJ2011009)

陳海丹(1982-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事免疫學研究。

符策崗(1991-)，男，碩士，主要從事骨外科研究。

R744

A

1005-9202(2016)20-5182-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.121

1 三峽大學醫學院