314例中國胃癌患者K-ras基因的突變狀態分析*

基金項目:上海市科委課題(13DZ2293100)。

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314例中國胃癌患者K-ras基因的突變狀態分析*

*基金項目:上海市科委課題(13DZ2293100)。

彭南求，趙新泰△

(上海賽安生物醫藥科技有限公司，上海 201900)

摘要:目的分析胃癌患者K-ras基因突變狀態，以期為胃癌患者的個體化治療提供指導。方法采用嵌套和COLD-PCR的方法分析314例胃癌患者K-ras基因突變狀態。結果在314例胃癌患者中，K-ras基因總體突變率是7.32%。19例血漿標本的突變率為0%。295例組織標本的突變率為7.80%。突變類型包括G12D、G13D、G12V，兩種不同標本之間K-ras基因的突變率并無顯著差異(P=0.206 1)；221例男性患者的突變率為6.79%，突變類型包括G12D、G13D，93例女性患者的突變率為8.60%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，不同性別之間K-ras基因的突變率之間無顯著差異(P=0.573 1)；45例青年人患者的突變率為6.67%，突變類型包括G12D、G13D，127例中年人患者的突變率為7.87%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，142例老年人患者的突變率為7.04%，突變類型包括G12D、G13D，不同年齡患者K-ras基因的突變率之間無顯著差異(P=0.995 3)。結論314例胃癌患者K-ras基因突變率是7.32%，突變類型主要為G12D、G13D，K-ras基因在不同標本類型、不同性別、不同年齡之間的突變率并無顯著差異。

關鍵詞:胃癌；K-ras；基因突變狀態

癌癥是一種高發病率、高病死率的全球性疾病，僅在2008年就造成760萬人死亡。過去的10年中，癌癥的病死率呈現降低的趨勢，大約118萬癌癥患者得到了有效的救治[1-2]。胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發病率和病死率一直居高不下，雖然手術可以根治，但術后的復發轉移嚴重影響患者的生存，由于缺乏對晚期胃癌及復發型胃癌的有效治療方案，目前胃癌的病死率居全世界惡性腫瘤的第2位[3]，對胃癌的早發現、早治療是提高臨床療效和降低病死率的有效方法[4]。K-ras基因編碼的p21-ras蛋白位于質膜上轉導細胞生長與分化的信號。K-ras突變主要發生在12、13和61編碼子上，這些突變造成K-ras激活[5]。K-ras突變與患者缺乏對EGFR單抗的反應有關,突變者不適用西妥昔單抗治療[6]。NCCN 2010年臨床指南中推薦：在接受西妥昔單抗治療前，進行K-ras基因突變檢測，確定是否接受該靶向治療。

本研究采用嵌套和COLD-PCR方法研究了314例中國人胃癌腫瘤血液標本中K-ras基因的突變狀態，同時比較了不同標本、性別和年齡群體中K-ras基因突變頻率的差異，以期能為西妥昔單抗藥物的使用提供參考依據。

1材料與方法

1.1標本來源本研究使用的臨床標本來自全國上百家三級醫院，包括19例血漿標本和295例組織標本。所有參與本研究的胃癌患者或其家屬均簽署過授權給上海賽安生物醫藥科技有限公司進行K-ras基因檢測的知情許可同意書。

1.2儀器與試劑試驗使用的Pfu酶購自上海申能博彩生物科技有限公司，dNTP購自上海申能博彩生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自Axygen Scientific Inc，所使用的PCR儀則購自杭州博日科技有限公司，離心機購自湘儀離心機儀器有限公司，PCR產物序列測定由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行。

1.3.2COLD-PCR-測序法檢測K-ras基因突變狀態用primer 5進行引物設計，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR-測序法被用于檢測K-ras基因的突變。

第1步 PCR擴增，常規PCR方法被用于擴增465 bp的大片段。所用引物為：正向， 5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′和反向 5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。10 μL PCR反應體系，包括：0.25 mmoL的dNTP、0.5 mmoL的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。 PCR程序如下：95 ℃預變性3 min，接著進行32個擴增循環：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min。

第2步 COLD-PCR COLD-PCR方法用于擴增155 bp的小片段。所用引物為：正向，5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′和反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。用50 μL的PCR反應體系，包括：0.25mmoL的dNTP、0.5 μmoL的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR產物。 PCR程序如下：95 ℃預變性3 min，先進行40個擴增循環：80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，隨后進行15個擴增循環：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃，5 min。

第3步 PCR產物純化測序，由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.4統計學處理采用SPSS20.0軟件進行數據處理及統計學分析，計數資料以例數或百分率表示，結果比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1PCR產物測序結果采用COLD-PCR-測序的方法，檢測K-ras基因突變狀態，其代表性結果如圖1所示。對COLD-PCR產物測序的代表性圖譜，指示胃癌患者K-ras基因第12位密碼子由GGT突變為GAT。

圖1　　COLD-PCR產物測序的代表性圖譜

2.2不同標本類型胃癌患者K-ras基因的突變情況本研究檢測了314例胃癌患者，K-ras基因總體突變率是7.32%。包括19例血漿標本和295例組織標本，血漿標本的突變率為0%，組織標本的突變率為7.80%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，兩種不同標本之間K-ras基因的突變率并無顯著差異(P=0.206 1)，詳見表1。

2.3不同性別胃癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在221例男性患者的突變率為6.79%，突變類型包括G12D、G13D，在93例女性患者的突變率為8.60%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，不同性別之間K-ras基因的突變率之間無顯著差異(P=0.573 1)，詳見表1。

2.4不同年齡群體胃癌患者K-ras基因的突變情況K-ras基因在45例青年人患者的突變率為6.67%，突變類型包括G12D、G13D，127例中年人患者的突變率為7.87%，突變類型包括G12D、G13D、G12V，142例老年人患者的突變率為7.04%，突變類型包括G12D、G13D，不同年齡患者K-ras基因的突變率之間無顯著差異(P=0.995 3)，詳見表1。

表1　　胃癌患者不同標本類型、性別、年齡群體中K-ras基因的突變頻率

-：無數據。

3討論

哺乳動物ras基因家族包括H-ras、K-ras、N-ras基因，分別編碼H-ras、K-ras、N-ras蛋白，它們具有相似的結構和功能。Ras蛋白位于細胞膜內側，將EGFR的信號轉導給促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，從而控制細胞的生長、增殖、運動，以及轉移和血管生成[7]。K-ras基因通常在第12、13和61位密碼子上發生點突變，這些突變常常激活K-ras癌基因[8]。K-ras基因的突變狀態和靶向EGFR單克隆抗體的治療效果相關，K-ras基因突變的患者，不適合愛必妥治療[9]。

多種方法被用于改進檢測的靈敏度，如變性高效液相色譜(DHPLC)[10]、嵌套等位基因特異性阻滯劑(ASB-)PCR[11]、PCR單鏈構象多態性(SSCP)[12]、限制性片段長度多態性(RFLP)[13]、以及擴增阻滯突變系統(ARMS)等[14]。由于對設備的要求簡單，且靈敏度高，COLD-PCR(在較低的變性溫度-PCR)是當前最廣泛使用的方法，它能富集不同的DNA片段，改進檢測的靈敏度[15-16]。

雖然手術是根治胃癌患者的最好方法，但由于很多患者發現時已經是胃癌晚期，因此，化療藥物的使用就顯得很重要，其中多西他賽就是典型，它通過阻斷細胞分裂，達到抑制細胞增殖的目的[17]，從而提高患者的無進展期和生存期，改善生活質量。術后復發轉移是導致治療失敗的重要原因，現在已經有很多標志物可以預測復發情況的發生，比如SOX-2、Beta-catenin等，通過檢測它們的表達，可以較好地預測胃癌患者術后的復發轉移[18-19]。

K-ras基因突變雖然不能作為胃癌患者的個體化治療指標，但是個體化醫療是新興的治療癌癥方法，它結合了分子生物學的手段，能更好地針對每個人的情況采取量體裁衣的治療，從而縮短治療的時間、提高生存期、改善患者的生活質量。

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·論著·

Analysis of K-ras gene mutation status in 314 Chinese patients with gastric cancer*

PengNanqiu,ZhaoXintai△

(ShanghaiShinesPharmaceuticalsCo.,Ltd.,Shanghai201900,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the mutation status of K-ras gene in the patients with gastric cancer to provide the guidance for the personalized therapy of gastric cancer.MethodsThe nested and Cold-PCR were adopted to analyze the K-ras gene mutation status in 314 cases of gastric cancer.ResultsIn 314 cases of gastric cancer,the total mutation rate of K-ras gene was 7.32%.The mutation rate was 0% in 19 plasma samples and 7.80% in 295 tissue samples.The types of mutation included G12D,G13D,G12V,the mutation rate of K-ras gene had no statistically significant difference between the two kinds of different samples (P=0.206 1);the mutation rate was 6.79% in 221 male patients,the types of mutation included G12D,G13D,the mutation frequency is 8.60% in 221 female patients,the types of mutation include G12D,G13D,G12V,the mutation rate of K-ras gene had no statistically significant difference between different genders (P=0.573 1);the mutation rate was 6.67% in 45 youth patients,the types of mutation included G12D,G13D,the mutation rate was 7.87% in 127 middle age patients,the types of mutation included G12D,G13D,G12V,the mutation rate was 7.04% in 142 old age patients,the types of mutation included G12D,G13D,there was no statistically significant difference among different age patients (P=0.995 3).ConclusionThe mutation rate of K-ras gene is 7.32% in 314 cases of gastric cancer,the main mutation types include G12D and G13D,and the mutation rate of K-ras gene has no significant difference among different samples,between different sexes and among different ages.

Key words:gastric cancer;K-ras;gene mutation status

收稿日期：(2015-07-19)

文獻標識碼：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.003A

文章編號：1673-4130(2015)24-3514-03

通訊作者△，E-mail:zhaoxintai@shineschina.com.

作者簡介：彭南求，男，主管檢驗技師，主要從事腫瘤個體化醫療工作。