酶聯半仿生法提取虎杖中白藜蘆醇工藝研究

陳　帥，王慧竹，王萬超，崔喜秀

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

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酶聯半仿生法提取虎杖中白藜蘆醇工藝研究

陳帥1，2，王慧竹1，王萬超1，崔喜秀1

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

摘要：目的：優選虎杖中白藜蘆醇的酶聯半仿生法提取工藝.方法：以白藜蘆醇提取率為指標，在單因素試驗基礎上，根據星點試驗設計原理，選取加酶量、酶解時間、酶解溫度3個因素進行試驗，利用響應面法優選提取工藝.結果：優選的提取工藝為加酶量1.7 mg·g-1，酶解溫度55 ℃，酶解時間107 min.在此工藝條件下白藜蘆醇提取率達5.91%，與預測值5.94% 較為接近.結論：采用響應面法優選的提取工藝合理可行，具有良好的預測性.

關鍵詞：酶聯半仿生法；虎杖；白藜蘆醇

虎杖(Polygonurn cuspidatum Sieb．et Zucc)為蓼科蓼屬多年生草本植物，藥用部位為根及根莖，具有祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰等功效[1].作為一種重要的中藥材原料，虎杖被廣泛用于治療腹瀉、發燒、關節痹痛、高血脂等癥[2].虎杖中的有效成分主要有蒽醌類成分和二苯乙烯類成分，其中以白藜蘆醇為代表的二苯乙烯類成分是虎杖發揮作用的主要功效成分.雖然有學者通過化學合成或生物合成制得白藜蘆醇[3]，或者從天然產物花生、葡萄中提取出白藜蘆醇，但大多數研究還是將虎杖作為提取白藜蘆醇的主要原料[4].實際生產中白藜蘆醇多用有機溶劑提取，如甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯等，其中乙醇為最常用溶劑[5-6]，但大部分白藜蘆醇苷被包裹在植物細胞壁內，一般的有機溶劑難以破壞細胞壁，提取率較低，而酶解作用可以使細胞壁疏松、破裂，從而減小傳質阻力，加速有效成分的釋放，進而提高提取率、提高原料的利用價值[7].半仿生法是模擬口服給藥及藥物經胃腸道轉運的原理，為經消化道給藥的中藥制劑而設計的一種提取工藝[8-9].本文嘗試將生物酶和半仿生法結合起來提取白藜蘆醇，并采用響應面法對提取工藝進行優化，以期最大限度地提高白藜蘆醇的提取率，降低提取成本，為工業化生產提供理論依據.

1實驗部分

1.1　試劑與儀器

虎杖(購于吉林大藥房，干燥后粉碎機粉碎過40目篩，密封保存，備用)，白藜蘆醇對照品(批號：MUST-11050301，成都曼斯特生物科技有限公司)，纖維素酶(150 000 U·g-1，寧夏和氏璧生物技術有限公司)，其他試劑均為分析純.

TU1950 紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，PHS-25型數顯pH計(上海精密科學儀器有限公司)，W5-100SP 恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，FA2004N 電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，DZ-2BCⅡ真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司).

1.2　實驗過程

1.2.1標準曲線的繪制

精密稱定白藜蘆醇對照品5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，置于冰箱中備用.準確吸取該溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得系列對照品溶液.于305 nm下測定吸光度(A).以吸光度(A)對濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A=136.90C+0.043 0，R2=0.999 6，線性范圍2-32 μg·mL-1.

1.2.2供試品溶液的制備

準確稱取虎杖粗粉1.0 g，定量加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，調節pH 2.0，50 ℃恒溫振蕩2 h，過濾，濾渣中添加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，調節pH 7.5，50 ℃恒溫振蕩2 h，過濾，濾渣中添加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，調節pH為8.3，50 ℃恒溫振蕩2 h，過濾，合并3次濾液，減壓濃縮得虎杖提取液，置100 mL容量瓶中，定容即得.

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1加酶量對白藜蘆醇提取率的影響

準確稱取虎杖粗粉5份，每份1.0 g，固定酶解時間90 min，酶解溫度為50 ℃，分別按0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg·g-1加酶后進行半仿生提取，合并3次濾液，減壓濃縮置于100 mL容量瓶中定容至刻度，按1.2.1方法測定白藜蘆醇吸光度，計算其提取率.

1.2.3.2酶解溫度對白藜蘆醇提取率的影響

準確稱取虎杖粗粉5份，每份1.0 g，固定加酶量1.5 mg·g-1，酶解時間為90 min，分別按酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃進行半仿生提取，合并3次濾液，減壓濃縮置于100 mL容量瓶中定容至刻度，按1.2.1方法測定白藜蘆醇吸光度，計算其提取率.

1.2.3.3酶解時間對白藜蘆醇提取率的影響

準確稱取虎杖粗粉5份，每份1.0 g，固定加酶量1.5 mg·g-1，酶解溫度為50 ℃，分別按酶解時間分別為30，60，90，120，150 min進行半仿生提取，合并3次濾液，減壓濃縮置于100 mL容量瓶中定容至刻度，按1.2.1方法測定白藜蘆醇吸光度，計算其提取率.

1.2.4響應面試驗

在單因素試驗基礎上確定加酶量(X1)、酶解溫度(X2)及酶解時間(X3)作為自變量，以白藜蘆醇提取率(Y)為響應值，根據星點設計原理，每個因素設3個水平，分別用編碼值-1、0、1表示，因素水平設計如表1所示.

表1　因素水平表

2結果與討論

2.1　單因素實驗結果

2.1.1加酶量對白藜蘆醇提取率的影響

由圖1可知，隨著加酶量的增加，提取率呈上升趨勢，當加酶量為1.5 mg·g-1時，提取率最大，之后隨著加酶量的增加，提取率呈減小趨勢.為進一步考察加酶量對提取率的影響，分別選擇1.0、1.5、2.0進行星點設計-響應面實驗.

加酶量/(mg·g-1)圖1　加酶量對提取率的影響

2.1.2酶解溫度對白藜蘆醇提取率的影響

由圖2可知，其他條件不變的情況下，白藜蘆醇提取率先隨酶解溫度的升高而增加，說明隨著溫度的升高，白藜蘆醇的溶出量增多；在50 ℃時提取量達最大值；當酶解溫度超過50 ℃后，白藜蘆醇提取率反而呈減少趨勢，說明過高的溫度可能會破壞白藜蘆醇中的某些活性成分，從而降低其提取率.為了進一步考察酶解溫度對提取率的影響，選擇40、50、60 ℃進行星點設計-響應面試驗.

酶解溫度/℃圖2　酶解溫度對提取率的影響

2.1.3酶解時間對白藜蘆醇提取率的影響

由圖3可以看出，其他條件不變的情況下，白藜蘆醇的提取率隨著時間的增加而增加，但在90～150 min之間其變化不明顯.結合實際，選取60、90、120 min進行星點設計-響應面試驗.

酶解時間/min圖3　酶解時間對提取率的影響

2.2　響應面實驗結果

響應面試驗結果如表2所示.

利用 SAS 9.4軟件進行多元回歸擬合分析，白藜蘆醇提取率對編碼自變量的二次回歸方程為：Y=-0.055 35 + 0.024 131*X1+ 0.002 375*X2+0.000 545*X3-0.011 923*X1*X1+ 0.000 15*X1*X2+0.000 067*X1*X3-0.000 035*X2*X2+0.000 012*X2*X3-6.062E-6*X3*X3

表2　響應面實驗表及結果

對上述回歸方程各系數進行顯著性檢驗及方差分析，結果如表3和表4所示.

表3　回歸系數顯著性檢驗

注：* 為顯著(P<0.05)；** 為極顯著(P<0.001)

表4　回歸方程的方差分析

注：* 為顯著(P<0.05)；* * 為極顯著(P<0.01)

由表3可知，對白藜蘆醇提取率影響最顯著的因素為酶解時間，加酶量和酶解溫度對白藜蘆醇提取率影響也達到了顯著水平(Pr>F值均小于0.05)，由于加酶量的Pr>F值大于酶解溫度的Pr>F值，因此酶解溫度對白藜蘆醇提取率影響大于加酶量，綜上各因素對白藜蘆醇提取率的影響次序為：酶解時間>酶解溫度>加酶量.

由表4可知[10-12]，回歸方程的Pr>F值小于0.001，說明所建立的二次多項式模型具有高度顯著性，線性項和二次項的Pr>F值小于0.001，說明其對白藜蘆醇的提取率的影響具有高度顯著性，模型的調整決定系數R2=96.20%，說明響應值的變化有96.2%來源于所選變量，而失擬項Pr>F值大于0.05，影響不顯著，說明模型擬合度好，可以較好地描述各實驗因素與響應值之間的關系.響應面為響應值對兩兩交互因素所構成的三維空間曲線圖，曲面越陡峭，表明該交互因素對試驗結果影響越大，為了更加直觀表達兩個因素同時對白藜蘆醇提取率的影響，可以將其中一個因素的值固定為零水平對應的值，僅考慮另外兩個因素對白藜蘆醇提取率的影響，根據回歸方程繪制響應曲面圖和等高線圖，結果如圖 4-6所示.

圖4　加酶量和酶解溫度同時對白藜蘆醇提取率影響的相應曲面圖和等高線圖

加酶量/(mg·g-1)圖5　加酶量和酶解時間對白藜蘆醇提取率影響的相應曲面圖和等高線圖

酶解溫度/℃圖6　酶解溫度和酶解時間對白藜蘆醇提取率影響的相應曲面圖和等高線圖

3結論

利用SAS軟件RSREG語句對模型進行典型性分析，得出最佳工藝條件：加酶量1.659 mg·g-1，酶解溫度55.177 ℃，酶解時間為107.166 min，在此工藝條件下，白藜蘆醇提取率為5.94%，但考慮到實際情況，將上述最佳工藝條件修正為加酶量1.7 mg·g-1，酶解溫度55 ℃，酶解時間107 min.在此修正工藝條件下進行三組驗證實驗，白藜蘆醇平均提取率為5.91%，與預測值偏差為-0.50%，由此可知回歸模型較好地反映了虎杖中白藜蘆醇的最佳提取工藝參數，同時也說明了該工藝條件的穩定.

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Optimization of Enzyme-linked Semi-bionic Extraction Technology

of Resveratrol from Polygonurn cuspidatum

CHEN Shuai1,2,WANG Hui-zhu1,WANG Wang-chao1,CUI Xi-xiu1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Teconology, Jilin132022,China;2.School of pharmacy, Shenyang Pharmacetical University,Shenyang110016,China)

Abstract:Objective:To optimize enzyme-linked semi-bionic extraction technology of Resveratrol from Polygonurn cuspidatum．Method: With yield of Resveratrol as index，based on single factor test，the principle of central composite design was adopted by selecting the amount of enzyme，enzymolysis time and temperature as factors，extraction technology was optimized by response surface methodology．Result: Optimum extraction conditions were as follows: the amount of enzyme 1.7 mg·g-1，enzymolysis time 107 min，enzymolysis temperature 55 ℃．Under these conditions，yield of Resveratrol was up to 5.91%，which was close to the predicted value (5.94%)．Conclusion: Optimized enzyme-linked semi-bionic extraction technology was reasonable and feasible with good predictability.

Key words:enzyme-linked semi-bionic extraction；Polygonurn cuspidatum；Resveratrol

文章編號：1007-2853(2015)11-0042-03 1007-2853(2015)11-0025-05

作者簡介：鄭永永(1989-)，男，山東荷澤人，北華大學2014級研究生，主要從事智能精密制造及其自動化方面的研究. 薛俊禮(1985-)，男，吉林松原人，吉林化工學院助教，碩士，主要從事固體超強酸方面的研究.

基金項目：吉林省科技發展計劃項目(20150520109JH)；吉林市科技創新發展計劃項目(201464043)(20156413)

收稿日期：2015-08-30 2015-07-20

中圖分類號：R 284.2

文獻標志碼：A DOI：10.16039/j.cnki.cn22-1249.2015.11.006