反向間接血凝試驗在畜禽病毒疾病診斷中的應用進展

莊金秋，梅建國，王玉茂，謝金文，莫玲，沈志強

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院山東濱州256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司山東濱州256600）

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反向間接血凝試驗在畜禽病毒疾病診斷中的應用進展

莊金秋1，2，梅建國1，2，王玉茂1，謝金文1，莫玲1，沈志強1

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院山東濱州256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司山東濱州256600）

摘要：反向間接血凝試驗（Reverse indirect hemagglutination test，RIHA）是一種簡單實用的實驗室檢測技術，已廣泛應用于人類及動物疾病的診斷及臨床檢測。本文概述了RIHA在動物病毒病診斷方面的應用進展，以期為獸醫臨床科技工作者更好地應用該法診斷疾病提供參考。

關鍵詞：反向間接血凝試驗；診斷；應用

反向間接血凝試驗（Reverse indirect hemagglutination test，RIHA）是以紅細胞為載體的間接凝集試驗，即用已知的抗體致敏紅細胞，然后與樣品在適宜的條件下反應，如樣品中含有目的抗原，則抗原抗體發生特異性結合，紅細胞會隨反應的發生出現肉眼可見的凝集現象。

1畜禽病毒病

1.1豬病

RIHA是我國鑒定口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）的行業標準，該方法能夠快速對FMDV進行初步鑒定。用口蹄疫A、O、C型的豚鼠高免血清與豬水皰病病毒（Swine vesicular diseasevirus，SVDV）高免血清抗體球蛋白致敏，用1%戊二醛、甲醛固定的綿羊紅細胞，制備抗體紅細胞與不同稀釋的待檢抗原，進行RIHA試驗，可在2～7 h內快速區別診斷豬水皰病和口蹄疫。何永強等（1999）通過單克隆抗體斑點酶聯免疫吸附試驗（McAb Dot-ELISA）和RIHA分別對豬FMDV和SVDV檢測比較，結果表明，McAb Dot-ELISA特異性強，快速簡便，比RIHA更為敏感、穩定和直觀。RIHA雖然靈敏度較高，但個別被檢抗原可能在低稀釋度孔內出現非特異性凝集。用豬瘟病毒（Clssical swine fever virus，CSFV）免疫血清提取IgG并且純化后，致敏綿羊紅細胞，建立RIHA方法，可用于檢測脾臟、淋巴結、扁桃體等病原較集中存在的組織中的CSFV抗原。不足之處在于用于處理組織病料的方法有差異，所以易對組織中的血細胞造成干擾，使得非特異性凝集出現而難以判定結果。吳平等（1991）通過單抗致敏的綿羊紅細胞建立RIHA試驗來檢測豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV），結果與血清中和試驗（SN）的符合率為94.4%，并認為RIHA可作為一種PRV的常規診斷技術。應用豬輪狀病毒（Rotavirus，RV）IgG，致敏經雙醛一次固定的綿羊紅細胞，可直接檢查樣品中RV。何孔旺等（1989）認為RIHA試驗能在1.5～2 h內直接從糞便樣品中檢測出RV抗原。

豬日本乙型腦炎又稱流行性乙型腦炎，是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種急性、人獸共患傳染病。應用RIHA試驗檢查，對感染的鼠腦檢測敏感性可達1∶1 000以上，具有較高的特異性和檢出率，可在3 h得到結果。黃志鑫等（1992）采集大約、長白、杜洛克和漢普夏等品種豬德血清87份，應用RIHA試驗檢測豬源乙型肝炎病毒抗原（HBsAg），陽性3份，陽性率3.4%，具有較好的特異性和敏感性。RIHA試驗在豬病診斷方面得到了較為廣泛的應用。

1.2羊病

在羊病方面，國內外已有研究人員成功建立了RIHA試驗檢測山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV），不僅可以檢測患病羊病料組織中的GPV，而且可以檢測感染細胞培養物中的GPV。用致敏的綿羊紅細胞進行山羊痘的診斷，其中綿羊紅細胞可用不同的方法致敏。Rao等（1997）試驗證明應用戊二醛或丹寧酸致敏綿羊紅細胞，在綿羊痘的診斷中取得較好的效果。王開功等（2003）、陳伯祥等（2015）以兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細胞，來檢測GPV抗原，并通過對貴州省疫區現場采集山羊痘待檢抗原的檢測，結果表明，RIHA方法較之瓊脂擴散試驗（AGP）要敏感，表明其建立的方法可用于山羊痘的診斷和流行病學檢測，是一種靈敏、操作簡單、快速的檢測方法。羊傳染性膿皰口炎是由羊傳染性膿皰病毒（Contagious ecthyma virus，CEV）引起的一種人畜共患的、接觸性的、嗜上皮性傳染病。陳燕軍（1982）用RIHA試驗對羊CEV進行了研究，證實了該方法的可行性和特異性。

1.3禽病

在禽病方面，趙新柳（1987）應用RIHA檢測雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），結果表明，用純度過高的抗原制備高免血清，致敏紅細胞后檢測IBV，敏感度反而下降；而用PEG濃縮病料后，IBV檢出率明顯提高。畢玉霞（2007）認為RIHA可用于檢測IBV抗原，但可靠性不及SN。樊曉京等（1997）應用反向間接血凝抑制試驗（RPHI）檢測雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）血清抗體，得到了滿意的效果。用RPHI 和AGP兩種方法同時測定67份雞血清，其中AGP檢出22份陽性，檢出率為32.8%；RPHI檢出62份陽性，檢出率為92.5%。在AGP陽性的22份血清中，RPHI亦均為陽性，而AGP陰性的45份血清中，RPHI檢出40份陽性。RPHI的檢出率比AGP高約60%。Deng等（1984）的研究報道證實，RIHA法檢測鴨瘟病毒（Duck Plague Virus）3h可判讀結果，操作簡便，不需昂貴的設備試劑，致敏細胞可長期保存，但敏感性較低，不適合少量DPV檢測。該方法對于DPV的定性檢測來說，感染病鴨大量排毒而使送檢組織存在大量病毒，RIHA足夠敏感，具有實用價值。徐為燕等（1981）應用RIHA檢測鵝胚尿囊液中的鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV），郭玉璞等（1994）對此法做了進一步完善。孫懷昌等（1989）將提純抗病毒單抗IgG致敏鵝或綿羊紅細胞建立了RIHA試驗，并對提純抗GPV抗原進行了檢測，結果顯示最低檢出濃度分別為34 ng/mL和26 ng/mL；對試驗感染鵝胚尿囊液、發病雛鵝組織及糞便的檢出率分別為 100%（10/10）、81%（27/33）和 91% （21/23）；結果還顯示該方法可以對番鴨細小病毒（MDPV）、雞新城疫病毒（NDV）、豬細小病毒（PPV）及犬細小病毒（CPV）進行鑒別診斷。該方法相對簡單，適用于大批量檢測GPV感染樣品。

2前景與展望

RIHA試驗可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質成分。紅細胞最常用的為綿羊、家兔、雞的紅細胞及O凝型人紅細胞。新鮮紅細胞能吸附多糖類抗原，但吸附蛋白質抗原或抗體的能力較差。致敏的新鮮紅細胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3 d。為此一般在致敏前先將紅細胞醛化，醛化紅細胞具有較強的吸附蛋白質抗原或抗體的能力，可長期保存而不溶血。RIHA所需設備簡單、操作簡便、只需在V型96孔微量反應板上進行，結果易判定，特異性和重復性良好，有很好的實用價值，3 h內即可作出診斷。由于RIHA具有特異性強，靈敏度高和便于操作等優點，適用于臨床診斷和少量樣品的檢測，易于在動物疾病診斷、生物制品研制和廣大基層養殖中推廣應用，具有廣泛的應用前景。（編輯：趙曉松）

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.6.046

基金項目：山東省重點研發計劃項目（2015GSF121027）；山東省現代農業產業技術體系毛皮動物創新團隊項目（SDAIT-18-011-15）。

作者簡介：莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫碩士，副研究員，主要從事細胞培養和動物用病毒疫苗研制。E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com

Progress on the Application of Reverse Indirect Hemagglutination Test in the Diagnosis of Animal Virus Diseases

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Wang Yumao1，Xie Jinwen1，Mo Ling1，Shen Zhiqiang1
（1.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong Province，256600；2.Bin Zhou Bio-carrier Biotechnology CO.，LTD，Binzhou，Shandong Province，256600）

Abstract：Reverse indirect hemagglutination test（RIHA）is a simple and practical laboratory testing technology，which has been widely used in the field of human and animal diseases and clinical detection.It was summarized that the Progress on the Application of RIHA in the diagnosis of animal virus diseases，in order to provide the reference for clinical veterinary science and technology workers.

Key words：Reverse indirect hemagglutination test；Diagnosis；Application