黃芩苷防治腦缺血作用機(jī)制

王龍梓

(山東淄博職業(yè)學(xué)院，山東　淄博　255314)

黃芩苷防治腦缺血作用機(jī)制

王龍梓

(山東淄博職業(yè)學(xué)院，山東淄博255314)

〔關(guān)鍵詞〕黃芩苷；黃芩素；腦缺血；抗氧化；炎癥反應(yīng)；信號通路

缺血性腦血管病主要病理生理表現(xiàn)為腦缺血和再灌注損傷，氧化損傷、炎癥反應(yīng)、鈣離子超載、血腦屏障損害、細(xì)胞凋亡等均是腦缺血損傷的重要病理生理機(jī)制。黃芩苷(BA)具有腦缺血保護(hù)作用。黃酮類化合物BA為常用中藥黃芩的主要活性成分，也是中藥清開靈注射液中的主要活性成分。BA屬葡萄糖醛酸苷類，水解后產(chǎn)生黃芩素(BAE)和葡萄糖醛酸。BA具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗感染、抗氧化等作用〔1，2〕。且BA可透過血腦屏障分布于腦組織〔3〕。大鼠行大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)導(dǎo)致腦缺血后，BA在腦組織中的分布明顯增多〔4〕。BA可通過多種機(jī)制防治腦缺血再灌注損傷。

1BA的抗氧化作用

氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中起核心作用。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí),體內(nèi)活性氧(ROS)自由基等產(chǎn)生過多，超出機(jī)體清除氧化物的能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷〔5〕。BA和BAE的神經(jīng)保護(hù)作用與其抗氧化作用密切相關(guān)。

BA通過抑制過氧化物的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化酶活性保護(hù)腦缺血再灌注損傷。Cao等〔6〕應(yīng)用沙鼠制備短暫性腦缺血再灌注損傷模型，腹腔注射50、100和200 mg/kg的BA。再灌注損傷7 d后檢測結(jié)果顯示，100和200 mg/kg BA明顯減輕腦缺血再灌注損傷的病理學(xué)變化，明顯增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、GSH過氧化物酶(GSH-PX)的活性，降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)水平。結(jié)果提示，BA可通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低過氧化物產(chǎn)生發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用。Xu等〔7〕發(fā)現(xiàn)BA通過清除超氧化物和與過氧化物反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)大的抗氧化作用。BA在體外可通過抑制外源性和內(nèi)源性過氧亞硝基陰離子誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性保護(hù)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞系；在大鼠MCAO模型，BA抑制缺血再灌注損傷腦組織中3-硝基酪氨酸的形成，減小腦梗死體積，這與過氧亞硝基陰離子分解催化劑FeTMPyP作用相似。BA通過強(qiáng)大的抗氧化活性產(chǎn)生腦保護(hù)作用，但有其作用時(shí)間窗。Cheng等〔2〕將BA用于MCAO小鼠，可通過降低ROS的產(chǎn)生，抑制MDA的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性等產(chǎn)生強(qiáng)大的抗氧化作用。BA抑制過氧化氫(H2O2)中介的新生SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷，改進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中的SOD活性，劑量依賴性強(qiáng)大的羥自由基(OH-)和二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除作用是重要的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。同時(shí)制備大鼠 MCAO模型，缺血1.5 h后實(shí)現(xiàn)再灌注。MCAO后0，2，4和6 h注射15 mg/kg BA。發(fā)現(xiàn)BA 4 h以內(nèi)應(yīng)用能改善MCAO大鼠神經(jīng)功能，減小腦梗死體積，降低細(xì)胞凋亡，而MCAO后6 h應(yīng)用則無明顯效果。提示BA治療腦缺血作用有時(shí)間限制，其保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的時(shí)間窗為MCAO后4 h內(nèi)。

BAE同樣通過抗氧化產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。Liu等〔8〕發(fā)現(xiàn)，在氧糖剝奪(OGD)導(dǎo)致缺血損傷的培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元模型中，黃芩素通過抑制ROS的產(chǎn)生減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷。但BAE腦保護(hù)作用效果可能與BA不同。研究顯示，BA和BAE對可逆性大鼠腦缺血均有明顯保護(hù)作用，但對于不可逆大鼠腦缺血，BA而不是BAE可明顯減小腦梗死體積和抑制細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生腦保護(hù)作用〔8，9〕。

清除體內(nèi)產(chǎn)生的ROS需要抗氧化酶的參與。人體內(nèi)主要的抗氧化酶有SOD、過氧化氫酶(CAT)、GSH-PX、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、醌還原氧化酶(NQOs)和血紅素加氧酶(HOs)等。上述抗氧化酶有共同的啟動(dòng)子，叫作抗氧化元件(ARE)。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/ARE的表達(dá)可以激活處于下游的上述抗氧化酶〔10〕。Johnson等〔11〕提出激活在氧化應(yīng)激細(xì)胞中的Nrf2-ARE信號通路是一種新的神經(jīng)保護(hù)途徑，可以抵御一系列的氧化、壓力相關(guān)的神經(jīng)病變。Lee等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)BAE通過活化Nrf2，進(jìn)而活化其中介的錳SOD(MnSOD)，抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷。Zhang等〔13〕發(fā)現(xiàn)，BAE預(yù)防性應(yīng)用明顯抑制6羥基多巴胺誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。BAE增加Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)，抑制kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1表達(dá)，具有時(shí)間和濃度依賴性。此外，BAE誘導(dǎo)Nrf2核易位，促進(jìn)ARE轉(zhuǎn)錄活化，保護(hù)6羥基多巴胺誘導(dǎo)的氧化損傷。BAE的這種作用可被Nrf2小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染，被HO-1抑制劑鋅卟啉(Znpp)及蛋白酶體抑制劑 MG132減弱。

2BA的抗感染作用

炎癥反應(yīng)是腦缺血損傷的關(guān)鍵因素之一。涂獻(xiàn)坤等〔14〕制備SD大鼠MCAO模型，腦缺血后2 h給予BA治療，缺血24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測。結(jié)果顯示，BA治療明顯降低腦梗死體積?？寡讬C(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血損傷可誘導(dǎo)髓過氧化物酶(MPO)的升高，BA 100 mg/kg可抑制缺血腦組織MPO的活性。提示炎癥反應(yīng)介導(dǎo)缺血性腦損傷的病理過程，BA具有抗感染作用。已知腫瘤壞死因子(TNF)-α是誘導(dǎo)腦缺血損傷的主要炎性細(xì)胞因子之一〔15〕，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺血腦組織TNF-α含量明顯升高，BA 100 mg/kg和200 mg/kg可減輕缺血腦組織TNF-α的分泌，進(jìn)一步說明BA可通過抑制炎癥性因子TNF-α減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血性腦損傷。核因子(NF)-κB是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的一個(gè)關(guān)鍵因素〔16〕。Xue等〔17〕應(yīng)用雄性Wistar大鼠制備MCAO模型，50、100 和200 mg/kg的BA于缺血后靜脈注射。缺血2 h再灌注24 h后檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用BA后，大鼠神經(jīng)功能明顯改善，腦梗死體積縮小，缺血腦損傷病理變化減輕，缺血再灌注大腦皮質(zhì)中高表達(dá)的NF-κB p65明顯降低。結(jié)果提示BA的腦保護(hù)作用與抑制NF-κB p65的表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)也與具有免疫激活功能的受體相關(guān)。NOD2是一種初始免疫反應(yīng)受體，與幾種炎癥反應(yīng)相關(guān)。Li等〔18〕將BA應(yīng)用于OGD神經(jīng)元細(xì)胞模型和腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)在OGD模型中的NOD2 和TNF-α的表達(dá)在BV2細(xì)胞，PC12細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞均上調(diào)，而10 μg/ml的BA明顯下調(diào)NOD2、TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)。同樣，50 μg/ml的BA也明顯下調(diào)腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型NOD2、TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果提示NOD2可作為BA通過抗炎發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)。

Toll樣受體(TLR)是炎癥反應(yīng)的初始因素〔19〕。TLR4是腦內(nèi)重要的免疫分子。腦內(nèi)TLR4被其相應(yīng)配體激活后，促使前炎癥因子產(chǎn)物釋放和其后的免疫應(yīng)答〔20〕。TLR2/4及其下游的NF-κB信號通路中介炎癥反應(yīng)，這是腦缺血損傷重要病理生理機(jī)制。Tu等〔21〕應(yīng)用成年SD大鼠制備不可逆MCAO模型，在MCAO后2 h和12 h兩次腹腔注射BA。MCAO后24 h檢測結(jié)果顯示，BA治療明顯降低MCAO后大鼠腦梗死體積，降低大鼠腦組織TLR2/4和NF-κB的表達(dá)，降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧酶(COX)-2的表達(dá)和活性。減少血清中TNF-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的含量。侯金才等〔22〕應(yīng)用原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，采用缺氧/復(fù)氧的方式制備體外缺氧再灌注實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用BA 25、50、100 μmol/L 3個(gè)濃度梯度進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧激活TLR4通路，并通過髓樣分化因子(MyD88)依賴途徑激活TLR4和下游蛋白MyD88、NF-κB、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、NF-κB抑制蛋白(I-κB)和p38；BA高劑量組明顯抑制了通路中TLR4、MyD88、NF-κB、ERK與p38蛋白的活性和I-κB蛋白的降解。Li等〔23〕考察了TLR2/4的體內(nèi)體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)，成功建立小鼠全腦缺血再灌注損傷模型和OGD初級神經(jīng)元和PC12細(xì)胞損傷模型，檢測結(jié)果顯示，腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ秃ｑR組織和OGD細(xì)胞損傷模型TLR2/4和TNF-α表達(dá)均明顯升高，而BA的治療則能明顯下調(diào)動(dòng)物模型和細(xì)胞模型的TLR2/4和TNF-α表達(dá)。上述研究表明，BA能抑制腦缺血后TLR2/4信號通路，抑制神經(jīng)損傷后炎癥反應(yīng)，TLR可能是BA的治療靶點(diǎn)。

3BA修復(fù)血腦屏障，抑制腦水腫

水通道蛋白(AQP)是新近發(fā)現(xiàn)的一組與水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的蛋白質(zhì)，AQP4在腦組織中表達(dá)最豐富,它是一種雙向水轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白,與腦水腫的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。且AQP-4在血腦屏障破壞中起著重要的作用〔24〕。BA可抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織AQP-4的表達(dá)，修復(fù)損傷的血腦屏障，抑制腦水腫，保護(hù)大鼠缺血性腦損傷〔14〕。Zhu等〔25〕應(yīng)用培養(yǎng)小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立體外血腦屏障模型，在此基礎(chǔ)上通過OGD建立體外缺血模型。發(fā)現(xiàn)OGD導(dǎo)致體外血腦屏障模型不穩(wěn)定性明顯增加。BA有效改善血腦屏障模型不穩(wěn)定性，促進(jìn)緊密連接蛋白(TJ)：閉合蛋白-5和胞質(zhì)緊密連接蛋白-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。結(jié)果提示BA可恢復(fù)缺血條件下的血腦屏障功能，這與其促進(jìn)TJ蛋白的表達(dá)有關(guān)。

局灶性腦缺血損傷導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9表達(dá)的增加，誘導(dǎo)血管源性的腦水腫，破壞血腦屏障的完整性。Tu等〔26〕應(yīng)用SD大鼠制備不可逆MCAO模型，在MCAO后2 h和12 h腹腔注射BA。MCAO后24 h檢測結(jié)果顯示，BA治療明顯降低MMP-9蛋白和 mRNA的表達(dá)。在MCAO后被抑制的緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，在BA治療后表達(dá)上調(diào)。BA的上述作用機(jī)制使腦水腫和血腦屏障不完整性得到明顯抑制。

4BA抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生

研究顯示，BA用于腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停诿黠@改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)知和記憶能力，減小腦梗死體積的同時(shí)，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2比值，降低COX-2的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔27，28〕。Cao等〔6〕發(fā)現(xiàn)BA可通過促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，抑制沙鼠缺血海馬組織促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白激酶(Caspase)-3的活性，抑制Caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)保護(hù)沙鼠全腦缺血再灌注損傷。由于BDNF可促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞再生〔29〕，因此BA對沙鼠全腦缺血的保護(hù)作用既與其抗細(xì)胞凋亡作用相關(guān)，也與其促進(jìn)神經(jīng)再生相關(guān)。

Li等〔30〕發(fā)現(xiàn)BA能誘導(dǎo)多能C17.2神經(jīng)干細(xì)胞分化，這種作用是由活化ERK1/2中介的，提示BA可能具有促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。Zhuang等〔31〕研究顯示，在內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞(NSPCs)增殖過程中，BA活化Mash1基因改變細(xì)胞分化，增加神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。并行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BA治療短暫性腦缺血大鼠3 w即改進(jìn)大鼠認(rèn)知功能，增加海馬新生細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)腦缺血后新的神經(jīng)元產(chǎn)生。

5BA與腦缺血損傷信號通路

許多基因、蛋白質(zhì)和信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌酸-3-激酶(PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)、NF-κB、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)等都與腦缺血再灌注損傷有關(guān)。有學(xué)者〔32〕提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)認(rèn)為，復(fù)雜疾病的治療應(yīng)該瞄準(zhǔn)整個(gè)疾病網(wǎng)絡(luò)，只有同時(shí)調(diào)節(jié)疾病網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)靶點(diǎn)才能有效干擾疾病表型。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以BA為代表的具有腦保護(hù)作用的天然化合物恰恰具有多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)。周才秀等〔33〕研究發(fā)現(xiàn)作為中藥清開靈注射液中的主要活性成分BA對小鼠缺血海馬組織基因表達(dá)的影響復(fù)雜，具有多樣性：可影響調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白氨基酸磷酸化、鈣調(diào)控、細(xì)胞骨架、細(xì)胞變異、細(xì)胞增殖和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等多方面功能基因表達(dá)。 Zhang等〔34〕考察BA對MCAO小鼠腦組織不同蛋白質(zhì)表達(dá)模式的影響，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，MCAO模型組檢測部位24種蛋白質(zhì)發(fā)生3倍量的改變，而BA治療MCAO組則沒有明顯的變化。蛋白相關(guān)基因分析顯示，這24種蛋白質(zhì)與15種生物學(xué)過程相關(guān)，包括細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程和生物調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)BA主要調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)蛋白，而調(diào)節(jié)壞死和凋亡蛋白作用相對較弱。Chen等〔32,35〕從信號通路水平和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平考察包括BA在內(nèi)的多種化合物對小鼠腦缺血再灌注損傷海馬組織基因表達(dá)和相應(yīng)信號通路的影響。發(fā)現(xiàn)BA使缺血損傷小鼠梗死體積明顯減小，明顯影響的靶基因達(dá)181個(gè)。

分析多種信號通路的相互作用是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)。為揭示缺血過程中不平衡的信號通路和藥理學(xué)機(jī)制，Liu等〔36〕應(yīng)用BA或BA聯(lián)合梔子苷治療MCAO小鼠。結(jié)果顯示缺血活化的Wnt信號通路和NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)被BA治療或BA聯(lián)合梔子苷治療明顯改變。Dai等〔37〕制備沙鼠全腦缺血再灌注損傷模型，沙鼠全腦缺血后立即腹腔注射200 mg/kg BA，再灌注7 d后檢測結(jié)果顯示BA治療明顯改善神經(jīng)功能，抑制缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，明顯促進(jìn)沙鼠全腦缺血后海馬組織 GABA(A)R α1、GABA(A)R γ2 和KCC2 等GABA信號分子蛋白和mRNA的表達(dá)，明顯增強(qiáng)熱休克蛋白(HSP)70和磷酸化(p)-ERK的表達(dá)，顯著減少磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化(p)-p38的表達(dá)。結(jié)果提示，BA活化全腦缺血后GABA信號通路，激活HSP70 和 MAPKs級聯(lián)反應(yīng)，這可能是BA神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

6BA防治腦缺血作用研究展望

天然化合物BA具有多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，可通過有效的抗氧化和抗炎作用，抑制腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，調(diào)節(jié)腦缺血損傷信號傳導(dǎo)通路等多種作用機(jī)制保護(hù)腦缺血再灌注損傷。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BA的治療腦缺血再灌注損傷的作用有其時(shí)間窗〔2〕，這對指導(dǎo)臨床天然腦保護(hù)藥物的合理應(yīng)用有重要意義。

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〔2014-03-19修回〕

(編輯王一涵)

〔中圖分類號〕R742

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2787-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.106

第一作者：王龍梓(1976-)，男，碩士，講師，主要從事心腦血管藥理學(xué)研究。