5種中草藥對不同分離株禽源大腸桿菌體外抑菌試驗

陳 彬，劉 碩，龔 爭※

（1.安徽省蚌埠市禹會區馬城鎮農辦，蚌埠 233411；2.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽 233100）

5種中草藥對不同分離株禽源大腸桿菌體外抑菌試驗

陳 彬1，劉 碩2，龔 爭2※

（1.安徽省蚌埠市禹會區馬城鎮農辦，蚌埠 233411；2.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽 233100）

為了探討5種具有清熱解毒功效中草藥水提液的體外抑菌活性，采用水煎法提取中草藥有效成分，以瓊脂擴散法分別測定金銀花、蒲公英、連翹、板藍根和甘草的水提物對本地分離的5株禽源大腸桿菌的抑菌活性及最小抑菌濃度(MIC)。結果表明，對本地5株禽源大腸桿菌抑菌圈最大的是連翹、金銀花，其抑菌圈直徑約在15～20mm，其次為蒲公英，其抑菌圈直徑在10～15mm。連翹、蒲公英、金銀花最小抑菌濃度在0.031～0.5g/mL，甘草對兩種大腸桿菌的最小抑菌濃度都在0.5g/mL。說明除板藍根外，其余4種中草藥對上述細菌具有不同程度的抑菌效果，連翹、金銀花的抑菌效果更佳。

中草藥；禽大腸桿菌；體外抑菌；最小抑菌濃度

畜禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的常見傳染病之一，為控制該病的發生，抗生素被養殖企業普遍應用，甚至出現濫用、超量使用的現象，導致耐藥菌株的大量出現，給動物疫病防控帶來嚴重的負面影響。有研究表明，致病性大腸桿菌已對多種抗生素表現耐藥性[1]，而且耐藥率在不斷增加，臨床上甚至已經出現了超強耐藥、多重交叉耐藥性的大腸桿菌，使該病的治療變得愈加困難[2]。同時，由于抗生素、化學藥物在動物產品中的殘留，產生較為嚴重的食品安全問題，這與國內畜牧業供給側結構向生產安全、綠色、健康畜禽產品的方向調整的發展戰略相悖。在動物疫病防控和動物源性食品安全雙重要求下，篩選高效、低毒、安全的抗菌藥物越來越迫切。中草藥作為我國的傳統醫藥，含有復雜抑菌成分，如多糖、生物堿等天然活性成分，不但具有促進動物生長、提高機體免疫力，增強抗病力的功效[3]，還具有抗菌譜廣、不易產生耐藥性、可以聯合應用等優點[4]。本文以金銀花、連翹、甘草、蒲公英、板藍根5種中草藥對不同禽源分離株大腸桿菌的體外抑菌試驗，旨在篩選具有較好抑菌效果的中草藥，為新型抗菌藥物研發和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥材和菌種 金銀花(Lonicerajaponica)、蒲公英(Herbahouttyniae Cordatae)、連翹(Fructusforsythiae Suspensae)、甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch)、板藍根(Radix isatidis)等均購自鳳陽華佗醫藥店；供試大腸桿菌H2、大腸桿菌F、雞源大腸桿菌、大腸桿菌GW、大腸桿菌G10代均為安徽科技學院動物科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2 儀器與試劑 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）、不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械廠）、水浴鍋（永興昌醫療器械廠）、GNP-9270BS電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械有限公司）、電磁爐（220V-AC，0-1 000W，北京科偉永興儀器有限公司）、AL204型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）、麥氏比濁管（0.5-5McFarland，北京中西遠大科技遠大科技有限公司）、游標卡尺（規格（0-150）mm×0.02mm，安徽桐城量具廠)、移液槍、打孔器等。試驗所需試劑蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、NaCI、KH2PO4、和NaOH等均為國產分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液的煎制 采用傳統的煎煮法制備5種中草藥的水提液[5]，稱取所需量藥材，將藥材放入攪拌機內打成粉末狀，再加入1 000mL蒸餾水浸泡2h，然后放入干凈的鍋內加熱，沸騰后溫度降至80℃再煎煮1h，用八層紗布過濾，藥渣再加800mL蒸餾水，加熱至沸騰，80℃文火保持1h，八層紗布過濾，合并2次的濾液，濾液經80℃恒溫水浴濃縮至藥量約1g/mL，121℃高壓滅菌20min，放入4℃冰箱保存。

1.2.2 菌種活化及濃度測定 試驗前將保存的各試驗菌種接種于普通瓊脂斜面培養基上使其活化，然后接種于2mL無菌新鮮肉湯中，在37℃恒溫培養箱中培養24h，用微量加樣槍吸取100μL菌液加入2mL無菌普通營養肉湯中進行擴陪，37℃培養18h，然后經比濁法進行活菌計數，測定后配制成1×106cfu/mL的菌液[6]。

1.2.3 中藥水提物體外抑菌試驗 對五種中草藥的水提液進行瓊脂擴散抑菌試驗[7]。按規程嚴格進行無菌操作，用微量加樣槍吸取100μL菌液均勻涂布于瓊脂培養基表面，再用直徑為6mm的打孔器在培養基上等距離打孔，外圍5孔，中心1孔，外圍5孔的每孔加入對應標號的無菌藥液100μL，中心孔加入生理鹽水50μL作為對照，置37℃恒溫培養箱中培養24h后觀察有無抑菌圈，并測量其直徑。每種藥液對5種試驗菌均做3個平行試驗，抑菌圈大小取3次結果的平均值。抑菌效果判定參照以下標準：抑菌圈直徑≥20mm為極敏，在15-19mm范圍內為高敏，在10-14mm為中敏，≤10mm為低敏[8]。

1.2.4 中藥水提物最小抑菌濃度的測定 采用試管倍比稀釋法測定中草藥水提液對5株禽源大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）。在無菌條件下，將五種中藥水提液分別倍比稀釋成含藥量0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001g/mL的藥液，然后再分別加入100μL的菌液，并設置相應的對照組，各稀釋藥液對每種供試菌均做了3次平行測定。置37℃恒溫培養箱中培養24h，通過觀察試管內的渾濁情況來判定細菌的生長情況。在本次試驗中，為了避免一些有顏色或渾濁的中草藥水提液對試驗結果造成影響，作用24h后我們將各試驗管內的培養液再接種到普通營養瓊脂平板上，置37℃恒溫培養箱中培養24h，通過觀察細菌在培養基上的生長情況來判定最小抑菌濃度。培養基上沒有細菌生長而且含中藥提取液濃度又最低者即為該種藥物對該種菌株的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結果與分析

2.1 中草藥水提取物的體外抑菌試驗

五種中草藥水提物體外抑菌試驗結果如表1所示。連翹、金銀花的水煮液抑菌效果較好，其抑菌圈直徑為15~20mm；其次為蒲公英，其抑菌圈直徑在10~15mm。

不同分離株大腸桿菌對不同藥液呈現不同的敏感性，連翹對大腸桿菌H2最為敏感，抑菌圈直徑大于20mm；連翹、金銀花對大腸桿菌F、大腸桿菌G10代的敏感性次之，抑菌圈直徑大于15mm；對雞大腸桿菌僅有連翹、金銀花有一定的抑菌作用。甘草對大腸桿菌H2和大腸桿菌GW的抑菌圈直徑在10mm以下，為低敏；而板藍根對5種本地分離株大腸桿菌均無抑菌效果。

表1 抑菌圈測定結果(mm)

2.2 中草藥水提取物的最小抑菌濃度測定

由篩選出的4種中草藥最小抑菌濃度測定結果（表2）可知，篩選出的4種不同中草藥提取物對5株禽大腸桿菌呈現出一定的抑菌活性，而且不同菌種對同一藥液也呈現不同的敏感性。其中金銀花、蒲公英、連翹的抑菌效果顯著優于其他中草藥，其中連翹、金銀花對試驗的5株大腸桿菌具有“廣譜”抑菌性；連翹對大腸桿菌H2、大腸桿菌F的最小抑菌濃度均達到0.031g/mL，蒲公英、金銀花對大腸桿菌F的最小抑菌濃度分別為0.031g/mL、0.063g/mL，連翹、金銀花對雞大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.5g/mL。

表2 最小抑菌濃度測定結果

3 討論與結論

中草藥及其有效成分抗菌作用機制主要是通過作用于細胞壁或細胞膜系統，作用于細菌細胞內的酶系統或功能蛋白及作用于遺傳物質或遺傳微粒結構而起作用[9]。更重要的是中草藥本身所含有的多種復雜有效成分能夠調節機體平衡，提高機體自身免疫力，增強機體被動免疫應答能力，調理和改善機體機能等方面是抗生素、化學藥物無法企及的。抗生素、化學藥物在動物產品中的殘留已引發極為嚴重的食品安全隱患。因此，為養殖業提供安全、高效、不易產生耐藥性的抗菌藥物在保障養殖業發展和生產健康、安全、綠色動物產品方面必將發揮積極的促進作用。

試驗結果表明，所選用的5種具有清熱解毒功效的中草藥中，連翹、金銀花對5株禽源大腸桿菌具有不同程度的抑制作用，蒲公英對其中的4株有抑菌作用，甘草僅對2株有較弱的抑菌效果，板藍根無抑菌效果。最敏感的為連翹、金銀花、蒲公英，其中連翹水煮液對5種本地常見禽源大腸桿菌的綜合抑制效果較好，MIC值較低。中草藥抗菌效力的測定對于抗菌藥物的篩選意義重大，本試驗結果為抗禽類大腸桿菌中草藥的研發和臨床應用提供參考。

考參文獻：

[1]馬紅霞，鄧旭明，歐陽紅生，等.不同源性大腸桿菌多藥耐藥基因AcrA、AcrB部分基因的同源性分析[J].中國預防獸醫學報，2003 (2):111-113.

[2]孫 喆，劉樹銘.20種中草藥對多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌作用[J].吉林畜牧獸醫，2009(11)：6-8.

[3]劉玉慶，李 曄，車程川，等.大腸桿菌對中草藥敏感性試驗及其方法研究[J].中獸醫醫藥雜志，2003(1):3-5.

[4]褚秀玲，蘇建青，韋旭斌.中藥抗大腸桿菌病研究進展[J].安徽農業科學，2008，36(21):9 093-9 094.

[5]陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].北京人民衛生出版社，1988: 69.

[6]張 莉，吳 潤，劉 磊.22種中草藥對畜禽常見腸道病原菌的體外抑菌作用[J].甘肅農業大學學報，2012，47(5)：7-11.

[7]徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法[M].北京人民衛生出版社，1991:1 346-1 347.

[8]楊建江，韓文瑜，杜 銳，等.30種中草藥對耐藥性豬鏈球菌的抑菌試驗[J].中獸醫醫藥雜志，2004，23(2):14-16.

[9]陳佳佳，廖森泰，孫遠明，等.中草藥抑菌活性研究進展[J].中藥材，2011，34(8):1 313-1 317.

責任編輯：吳艷玲

The Antimicrobial Tests of Five Kinds of Chinese Herbal Medicine on Different Escherichia Colis from Local Poultry in Vitro

CHEN Bin1,LIU Shuo2,GONG Zheng2
(1.Office of Agriculture in Macheng Town,Yuhui Region,Bengbu City,Anhui Province,Bengbu 233411；2.Anhui Science and Technology University College of Animal Science,Fengyang 233100）

To investigate the antibacterial activity of Chinese herbal medicine extracted liquid with the function of heat-clearing and detoxifying from honeysuckle,dandelion,forsythia,Radix isatidis and Radix glycyrrhizae on five Escherichia coli from local poultry in vitro.The effective components of Chinese herbal were extracted by water decoction method.The antimicrobial activity and minimal inhibitory concentration(MIC)of the water extracts were determined by the agar diffusion method.The results showed that the significant effect of antibacterial activities on five Escherichia coli from local poultry was forsythia and honeysuckle,and the diameter of their bacterial inhibition zones was about 15~20mm.Secondly,the diameter of the inhibition zone from dandelion was 10~15mm.The minimum inhibitory concentration of Forsythia,dandelion and honeysuckle was 0.031~0.5g/mL.Moreover,The minimum inhibitory concentration of licorice on two Escherichia coli was 0.5g/mL.Exceptisatis root,the antibacterial activities of four other Chinese herbal medicine had a different inhibitory effects on those bacteria.And the most significant antibacterial effect was forsythia and honeysuckle.

Chinese herbal medicine;Escherichia colis from poultry;antimicrobial tests in vitro;minimal inhibitory concentration

S855.1

A

2016-07-15

安徽科技學院自然科學研究項目（ZRC2014439）；安徽科技學院重點學科建設項目（AKZDXK2015B03）

陳 彬（1968-），男，安徽省懷遠縣人，助理畜牧師，從事畜禽生產技術推廣與應用。

※為本文通訊作者