金納米團簇標記PLGA支架的研究

王祥盛 王賢松 張智勇 周廣東 劉 偉 曹誼林 張文杰

·論著·

金納米團簇標記PLGA支架的研究

王祥盛 王賢松 張智勇 周廣東 劉 偉 曹誼林 張文杰

目的探討金納米團簇用于示蹤可降解高分子支架的可行性，為非侵入成像方式監測體內組織工程支架降解提供方法和思路。方法用氯金酸和牛血清白蛋白（BSA）為原料合成金納米團簇（Au Nanoclusters，AuNCs），進行相關表征及細胞毒性檢測。以AuNCs標記聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），制備AuNCs/PLGA支架，掃描電鏡檢測支架表面結構，熒光及CT掃描檢測支架特性。將支架植入裸鼠皮下，應用熒光成像及Micro-CT掃描，以觀測支架在體內的情況。結果合成的AuNCs具有熒光特性，無細胞毒性；納米團簇標記的PLGA支架保持熒光特性，同時在CT掃描中可顯影；AuNCs/PLGA支架可以在裸鼠皮下通過熒光成像及Micro-CT掃描來示蹤。結論AuNCs可作為組織工程支架的示蹤劑，為非侵入成像方式監測體內高分子組織工程支架降解情況提供可能。

金納米團簇支架材料非侵入成像

理想的組織工程支架材料的重要特征之一，是具有與組織形成相匹配的降解速率[1]。因此，無創且動態監測支架材料的降解是一個亟待解決的難題。非侵入成像技術（Non-invasive Imaging Technology，NIR）包括CT、MRI和熒光光學成像等技術，為無創動態監測體內組織工程支架材料的降解提供了可能性。然而，生物大分子和高分子聚合物等組織工程支架常用材料，無法采用上述方法成像或顯影。因此，需要開發一種能長期標記支架材料的“造影劑”，用于非侵入成像技術，以此來達到無創監測體內組織工程支架降解的目的。

金納米團簇（Au Nanoclusters，AuNCs）是一種新型的熒光納米材料，生物毒性小，具有穩定的激發熒光，和良好的X線衰減效應[2]。本實驗中，我們利用牛血清白蛋白（BSA）和氯金酸（HAuCl4）為原料，合成BSA包裹的金納米團簇，驗證其光學特性和生物毒性，并用該團簇標記組織工程常用的高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA），利用熒光成像和CT掃描等方式，監測該支架在動物體內的情況，探討利用金納米團簇來示蹤組織工程支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

主要試劑：氯金酸（HAuCl·43H2O，99%）、牛血清白蛋白（BSA）、1.4-二氧六環（國藥集團上海化學試劑有限公司）；PLGA（50∶50，Mw 38 000～54 000）（Sigma，美國）。

主要儀器：Micro-CT（Scanco Medical，美國）；小動物成像儀（PerkinElmer，美國）；掃描電鏡（Phenom，荷蘭）；紫外分光光度計（Beckman，美國）；酶標光度計（Thermo，美國）。

實驗動物：6周齡BALB/c裸鼠6只（本院SPF級動物實驗中心提供）。

1.2 金納米團簇的合成與表征

1.2.1 金納米團簇的合成

在攪拌條件下，將BSA溶液（10 mL，25 mg/mL）加入到氯金酸溶液（10 mL，10 mM）中，加入NaOH溶液（1 mL，1 mol/L），繼續攪拌1 h后停止，然后使混合溶液在37℃溫度下孵育12 h，即可得到穩定的金納米團簇溶液。

1.2.2 金納米團簇的表征

以高分辨率透射電鏡觀察合成的金納米團簇粒子的形貌及粒子大小。用紫外分光光度計測定金納米團簇的吸收光譜，其光譜測量范圍為400～700 nm。用酶標光度計測其在440 nm激發光下的熒光發射光譜。高分辨率掃描電鏡測其粒子的形貌。

1.2.3 金納米團簇的毒性測定

利用人臍靜脈內皮細胞系（HUVEC，來源于本實驗室）檢測金納米團簇的細胞毒性。將HUVEC以10 000個/孔的密度均勻接種于iCELLigence實時細胞檢測儀的培養板里，實驗組中加入1 000 nM的金納米團簇溶液，對照組中加入同量的PBS溶液。細胞檢測儀檢測第1、2、3、4、5天的細胞的指數。

1.3 支架制備與表征

將合成好的金納米團簇凍干制成粉末，取20 mg加入到1 mL的1.4-二氧六環中，經超聲震蕩使其充分分散，再加入100 mg的PLGA，攪拌2 h。經凍干成型后得到多孔的AuNCs/PLGA支架。同樣通過冷凍干燥法制備單純的PLGA支架。將兩種材料制備成直徑10 mm，厚2 mm的圓片。60Co消毒備用。將上述方法制備得到的兩種支架噴金鍍膜，掃描電鏡下觀察。利用365 nm便攜式紫外燈照射兩種支架，檢測其熒光情況，同時用Micro-CT來掃描兩種支架，觀察在CT中的顯影情況，并測量CT值。

1.4 支架植入裸鼠皮下

腹腔麻醉后，在裸鼠后背正中近尾端處作1 cm長的直線切口，并鈍性分離皮膚與皮下組織，將消毒好的AuNCs/PLGA支架植入左側，單純的PLGA支架植入右側。術后切口處涂抹紅霉素軟膏預防感染。共植入6只裸鼠。

1.5 熒光成像和Micro-CT掃描

支架植入后第三天，將裸鼠吸入麻醉后置入小動物成像儀中，檢測皮下支架的熒光情況，并熒光成像拍照和測算其熒光強度。以此時間點為第一周，此后每周同一時間點監測支架的熒光情況，連續監測5周。分別記錄每周支架的熒光成像結果和熒光強度數值。制作熒光強度隨時間變化的曲線。

1.6 統計分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，實驗組與對照組的比較采用配對t檢驗及方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 金納米團簇的合成和表征

金納米團簇在正常光下呈棕黃色，365 nm便攜式紫外光照下呈現紅色熒光。透射電鏡結果顯示，合成的金納米團簇顆粒呈大小分布均勻的球狀粒子，平均粒徑約為3 nm，這與相關報道基本一致[3]。金納米團簇在400～700 nm的吸收光譜和在激發光為440 nm下的熒光光譜顯示，該納米團簇在520 nm處呈特征吸收峰；當以440 nm為激發波長時，可發現金納米團簇的發射波峰位于700 nm附近，符合紅色熒光的波長范圍（圖1）。

2.2 金納米團簇的細胞毒性

第1～5天實驗組和對照組的細胞指數顯示，金納米團簇溶液（實驗組）中HUVEC的細胞指數分別是PBS溶液（對照組）的99.8%、102.0%、104.5%、105.9%和105.4%，平均相對增殖率是103.5%，其中第2～4天，實驗組與對照組差異明顯（P＜0.05），第1和5天，實驗組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。依據細胞相對增殖率與細胞毒性分級關系，金納米團簇溶液在第1、2、3、4、5天的細胞毒性分別是I級、0級、0級、0級和0級，說明金納米團簇對細胞無毒性（圖2）。

2.3 支架制備和表征

通過冷凍干燥法制備AuNCs/PLGA和單純的PLGA支架，均為圓盤狀，直徑10 mm，厚度2 mm，其中AuNCs/PLGA支架外觀呈淡粉色，而單純PLGA支架外觀呈白色。掃描電鏡觀察發現，兩種支架的孔徑都在50 μm左右，孔隙分布不均勻。用激發波長為365 nm的紫外光照射兩種支架，可以發現單純PLGA呈現紫藍色，無激發熒光；而AuNCs/ PLGA支架則呈較為均勻的紅色熒光。Micro-CT掃描兩種支架，可以發現單純PLGA支架基本不顯影，而AuNCs/PLGA支架則為均勻的高密度影；AuNCs/ PLGA支架的CT值為200 HU，高于軟組織（20～50 HU）或內臟器官（40～100 HU）（圖3）。

2.4 熒光和CT雙模式成像結果

分別在同一只裸鼠的皮下植入兩種支架，單純PLGA支架植入右側，AuNCs/PLGA支架植入左側。應用小動物成像儀檢測材料熒光情況，可以看到全部6只裸鼠的AuNCs/PLGA支架可有明顯的熒光成像，而單純PLGA支架無熒光成像。Micro-CT掃描重建可見AuNCs/PLGA支架顯影清晰，與周圍軟組織區分明顯，而單純PLGA支架基本不能顯影，無法和周圍軟組織鑒別。通過三維重建，可以看到AuNCs/PLGA支架的精確三維結構。這表明通過標記金納米團簇于PLGA支架上，不僅可以通過熒光強度來監測材料的狀態，還能通過CT成像了解支架在體內的三維結構和形態變化（圖4）。

圖1 金納米團簇的表征Fig.1Characterization of AuNCs

圖2 HUVEC在AuNCs作用下的生長曲線Fig.2The growth curves of HUVEC coincubation with AuNCs in the cell medium

圖3 單純PLGA支架和AuNCs/PLGA支架大體觀及表征Fig.3Gross observation and Characterization of PLGA and AuNCs/PLGA scaffolds

圖4 體內支架熒光變化（5周）Fig.4 Fluorescence change of scaffold in vivo within 5 weeks

3 討論

傳統組織工程支架降解的研究通常采用組織切片染色法，以確定支架材料的降解和組織再生情況，無法實現同一動物體內的連續觀察，且不適用于臨床研究。目前，快速發展的非侵入成像技術（Noninvasive Imaging Technology，NIR），包括CT、MRI和熒光光學成像技術[3]，為動態監測體內組織工程支架材料降解提供了可能。然而，生物大分子或高分子聚合物等組織工程支架材料，無法采用上述方法成像或顯影。Natalie等[4]通過有機熒光染料標記可降解支架材料聚乙二醇（PEG），并在大鼠模型上成功實現熒光光學成像。但是，有機染料在生物體內長時間應用過程中，存在熒光信號不穩定，甚至淬滅等問題，不適合作為體內長期研究的熒光探針，因而限制了熒光成像技術在支架材料研究領域的應用[5-6]。Kim等[7]通過兩性離子近紅外熒光納米分子探針，標記膠原支架，并對其進行了長時間小鼠體內近紅外熒光成像。結果表明，熒光成像可以實時示蹤膠原支架在體內代謝的動態過程。然而熒光分子探針和熒光成像系統雖然能對支架材料的降解情況在細胞、分子水平上進行示蹤，具有很高的靈敏度，但是只能平面成像，無法獲得活體三維結構。同時，熒光探針在代謝時有可能被周圍細胞吸收，從而進入新生組織中，熒光殘留其中時，無法區分新生組織的殘留熒光和原支架材料熒光。而Micro-CT成像技術剛好可以解決熒光成像的不足，與熒光成像技術構成互補，能彌補熒光成像無法獲取的支架材料三維空間結構信息。Micro-CT成像具有較高的時間和空間分辨率，安全可靠。更為重要的是，Micro-CT能區分新生組織里的殘留熒光和原支架材料熒光。如果生物體內的支架材料能夠同時進行熒光成像和Micro-CT雙模式成像，則可以順利對支架材料的降解和組織再生進行動態監測。然而，Micro-CT成像對密度低的高分子材料或聚合物等成像效果差，與組織之間無法區分，甚至不能成像。因此，開發“支架材料造影劑”，使其具有熒光成像特性，且能提高Micro-CT材料三維空間上的分辨率具有重要意義。

金納米團簇是一種新型的熒光納米材料，是在分子層保護下，由幾個到幾百個金原子組成的相對穩定的聚集體，相比小分子熒光染料和量子點，金納米團簇具有毒性低、表面易于修飾、熒光穩定性強且可調、Stokes位移大等優點[8]。同時，由于金元素比碘元素具有更高的原子序數和X線衰減特性，故在X線成像中具有更高的增強效應[9]。金納米團簇在小動物血管造影和腫瘤成像中都具有良好的成像效果[10]。

本實驗中，我們利用無細胞毒性的牛血清白蛋白作為包裹分子，來合成金納米團簇，同時我們選用目前廣泛使用的、非侵入成像技術無法顯影和監測的支架材料PLGA作為研究對象[11]。我們發現，合成的金納米團簇，具有強烈的紅色激發熒光。紅色熒光具有波長較長、易于穿透生物體、能避免生物體內自發熒光干擾的優勢。同時，金納米團簇能明顯提高PLGA的密度，在CT掃描下具有良好的成像效果，能與周圍軟組織明顯區分。本實驗中合成的金納米團簇無細胞毒性，可用于體內實驗。基于以上實驗結果，我們認為金納米團簇可作為標記支架材料的特殊“造影劑”，結合近紅外熒光和Micro-CT雙模式成像，可建立無創動態監測體內支架材料降解的模型。

我們認為，金納米團簇可以監測支架的降解，隨著支架材料在體內的降解，解體的材料單體和熒光納米探針將被釋放和清除，修復區域的熒光會越來越弱，密度也會逐漸降低，直至支架完全降解而消失，此時降解區會形成熒光空洞，并且通過CT掃描后的三維重建，可以看到具體形態的變化。

雖然在本實驗中已經驗證了合成的金納米團簇可以標記組織工程支架，并且能通過熒光成像和CT掃描的方式檢測其在體內的情況，然而在實際的降解過程中，熒光強度的變化、CT成像的變化是否與支架降解的實際情況相一致，即該方法的精確度，還需通過進一步的實驗來加以驗證。

[1]Griffith LG.Emerging design principles in biomaterials and scaffolds for tissue engineering[J].Ann N Y Acad Sci,2002,961:83-95.

[2]Chen LY,Wang CW,Yuan Z,et al.Fluorescent gold nanoclusters: recent advances in sensing and imaging[J].Anal Chem,2015,87 (1):216-229.

[3]Na JH,Koo H,Lee S,et al.Real-time and non-invasive optical imaging of tumor-targeting glycol chitosan nanoparticles in various tumor models[J].Biomaterials,2011,32(22):5252-5261.

[4]Artzi N,Oliva N,Puron C,et al.In vivo and in vitro tracking of erosion in biodegradable materials using non-invasivefluorescence imaging[J].Nat Mater,2011,10(9):704-709.

[5]Owens EA,Hyun H,Kim SH,et al.Highly charged cyanine fluorophores for trafficking scaffold degradation[J].Biomed Mater, 2013,8(1):014109.

[6]Lv F,Cao B,Cui Y,et al.Zinc phthalocyanine labelled polyethylene glycol:preparation,characterization,interaction with bovine serum albumin and near infrared fluorescence imaging in vivo[J]. Molecules,2012,17(6):6348-6361.

[7]Kim SH,Lee JH,Hyun H,et al.Near-infrared fluorescence imaging for noninvasive trafficking of scaffold degradation[J].Sci Rep,2013,3:1198.

[8]Zheng J,Nicovich PR,Dickson RM.Highly fluorescent noblemetal quantum dots[J].Annu Rev Phys Chem,2007,58:409-431. [9]Rabin O,Manuel PJ,Grimm J,et al.An X-ray computed tomography imaging agent based on long-circulating bismuth sulphide nanoparticles[J].Nat Mater,2006,5(2):118-122.

[10]Zhou Z,Zhang C,Qian Q,et al.Folic acid-conjugated silica capped gold nanoclusters for targeted fluorescence/X-ray computed tomography imaging[J].J Nanobiotechnology,2013,11:17.

[11]Lu L,Peter SJ,Lyman MD,et al.In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glycolic acid)foams[J].Biomaterials, 2000,21(18):1837-1845.（收稿日期：2016年9月4日；修回日期：2016年10月26日）

Labeling PLGA Scaffold with Gold Nanoclusters

WANG Xiangsheng,WANG Xiansong,ZHANG Zhiyong,ZHOU Guangdong,LIU Wei,CAO Yilin,ZHANG Wenjie.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200240,China.Corresponding author: ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of using Au nanoclusters(AuNCs)to label the tissue engineering scaffold which degradation could be further monitored by noninvasive approach in vivo.MethodsChlorauric acid and bovine serum albumin(BSA)were used to synthesize AuNCs.The nanoclusters were characterized and their cytotoxicity was evaluated. AuNCs were then mixed with poly lactic-co-glycolic acid(PLGA)to fabricate AuNCs/PLGA scaffold.The scaffolds were implanted subcutaneously in nude mice.Fluorescence imaging and CT scanning were performed to detect the scaffolds in vivo.ResultsSynthesized AuNCs possess fluorescence without cytotoxicity.The AuNCs labeled PLGA scaffolds were detected by fluorescence imaging and CT scanning in vitro.The scaffolds were detected by these two noninvasive methods after being implanted in nude mice.ConclusionAuNCs could be potentially used for labeling polymer scaffold,which degradation could be possibly monitored by non-invasive imaging technology.

Au nanoclusters;Scaffold;Non-invasive imaging

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）06－0331－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.001

國家自然科學基金（81271714，31170944）；上海市科委基礎重點研究項目（15JC1490600）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室；200240上海市組織工程國家工程中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。