糖尿病小鼠心肌組織中動力相關蛋白1的表達變化

荊哲，劉峰舟，陳永清，劉燕，陳沖，景策

(1.蘭州軍區蘭州總醫院心血管內科，蘭州 730050；2.解放軍九四一九五部隊衛生隊；3.解放軍第四五一醫院門診部；4.第四軍醫大學西京醫院內分泌科)

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糖尿病小鼠心肌組織中動力相關蛋白1的表達變化

荊哲1，劉峰舟2，陳永清1，劉燕1，陳沖3，景策4

(1.蘭州軍區蘭州總醫院心血管內科，蘭州 730050；2.解放軍九四一九五部隊衛生隊；3.解放軍第四五一醫院門診部；4.第四軍醫大學西京醫院內分泌科)

目的 觀察db/db糖尿病小鼠與正常小鼠心肌組織中動力相關蛋白1(Drp1)表達水平的變化。方法 9只雄性db/db糖尿病小鼠，隨機分為6周組(db/db 6week)，12周組(db/db 12week)，18周組(db/db 18week)；另設健康組雄性小鼠9只，隨機分為6周組(wt 6week)，12周組(wt 12week)，18周組(wt 18week)，每小組3只。分別利用實時定量PCR，Western Blot，免疫組織化學的方法檢測心肌組織中Drp1的表達和定位。結果 db/db糖尿病小鼠分組中Drp1的表達低于健康組，且隨年齡的增長表達逐漸降低。結論 糖尿病小鼠中Drp1表達進行性的降低，引起線粒體分裂異常從而導致線粒體的生物功能障礙，可能是糖尿病心肌病發生及發展的重要機制之一。

糖尿病,2型；心肌；動力蛋白質Ⅰ；線粒體,心臟；小鼠，近交DBA

糖尿病是一種以胰島素分泌絕對或者相對不足為主要特征，表現為高血糖、高血脂的代謝紊亂性疾病[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，發病率逐年增高，近年來流行病學調查發現，糖尿病患者中70%以上死于心血管相關性疾病，明顯高于非糖尿病患者心血管系統疾病[2]。而其中糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者主要心臟并發癥之一[3]。糖尿病心肌病是糖尿病引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌多處局灶性壞死[4]。早期主要表現為心肌順應性下降和舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主要表現，嚴重時可發展為充血性心力衰竭[5]。

線粒體在細胞的生命進程中發揮著重要的生物學功能[6]，有研究顯示，線粒體功能障礙對糖尿病心肌病的發生及發展起著直接作用[7]。其中線粒體融合與分裂這一動態平衡的穩定，對于維持線粒體自身生物學功能至關重要[8]。動力相關蛋白1(Drp1)是介導線粒體分裂的重要分子之一，又被稱為DLP1(dynamin-like protein 1)，該分子為一個大GTP酶分子，結構為N端具有GTP酶結構域，C端為GTP酶效應結構域，中間為Dynamin同源結構域[9-10]。Drp1主要分布于細胞漿中，但其結構中的一部分在線粒體管狀結構上呈點狀分布，為線粒體的分裂位點[11]。雖然目前已有研究證實在心血管病相關事件中存在著線粒體分裂與融合的動力學改變[12-13]，但目前尚未見有關線粒體動力學相關研究在糖尿病心肌病中的報道。

本研究通過構建小鼠糖尿病心肌病模型，探討不同周齡糖尿病心肌組織中Drp1的表達變化，期望進一步闡述糖尿病心肌病中心肌線粒體分裂與融合這一動力學變化在糖尿病心肌病發生及發展中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 動物實驗方法 根據實驗設計，采用隨機數字表法，將9只雄性db/db糖尿病小鼠隨機分為3組，每組3只，分別飼養至6周(db-6W)，12周(db-12W)，18周(db-18W)；另將9只健康雄性小鼠分為三組，每組三只，分別飼養至6周(wt-6W)，12周(wt-12W)，18周(wt-18W)。動物購自常州卡文斯實驗動物有限公司(動物許可證號：SCXK蘇2011-0003)。飼養到對應周齡后處死，取心臟左心室組織供實驗使用。

1.2 Western Blot檢測Drp1蛋白表達水平 采用聚丙烯凝膠電泳(10%分離膠，5%濃縮膠)，80 V進行上層膠電泳，120 V進行下層膠電泳2 h后，采用濕轉的法將蛋白轉移到PVDF膜上(100 V恒壓，1 h)。5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，Drp1抗體(購自美國Santa cruz公司)稀釋比例為1∶500，β-actin抗體(購自武漢三贏公司)稀釋比例為1∶3000,4 ℃封閉過夜，兔二抗IgG抗體室溫孵育2 h后，化學發光試劑盒進行檢測。

1.3 實時定量PCR檢測Drp1 mRNA表達水平 采用實時定量PCR方法對不同處理組中心肌組織Drp1的mRNA表達水平進行檢測。Trizol(購自美國Invitrogen公司)法提取心肌組織的總RNA后反轉錄為cDNA。采用實時定量PCR法檢測，嚴格按照PCR檢測試劑盒的說明書操作(購自TaKaRa公司)。擴增Drp1基因的引物序列上游為：5'-CGTAGTGGGAACGCAGAG-3'，下游為5'- ACAGGCACCTTGGTCATT-3';擴增內參GAPDH基因的引物序列上游為：5'- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游為5'- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。

1.4 免疫組織化學檢測Drp1的表達及定位 采用免疫組織化學方法對Drp1的表達水平進一步驗證并觀察其表達定位。Drp1稀釋比例1∶100。3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，檸檬酸鈉高壓煮沸3 min抗原修復，10%正常羊血清孵育，加一抗后4 ℃過夜，PBS緩沖液震蕩清洗后分別滴加二抗及三抗，DAB顯色，蘇木素復染后，常規封片。

1.5 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件進行處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織Drp1 mRNA表達 分別飼養db/db及健康組小鼠6周，12周，18周后，采用實時定量PCR檢測Drp1 mRNA表達。結果顯示，db/db小鼠心肌組織中Drp1的mRNA水平明顯低于健康組水平，且隨著周齡的增長表達逐漸降低，見圖1。

2.2 心肌組織 Drp1蛋白表達 為了進一步明確Drp1在糖尿病心肌組織中的表達情況，采用Western Blot檢測Drp1在心肌組織中的蛋白表達水平。結果顯示，db/db小鼠心肌組織中Drp1的蛋白表達明顯低于健康組水平，且隨著周齡的增長表達逐漸降低，這與實時定量PCR的結果相一致(圖2)。

2.3 免疫組織化學 通過實時定量PCR及Western Blot檢測明確了在db/db糖尿病小鼠中Drp1的mRNA及蛋白表達水平較健康組明顯降低，為了進一步探究Drp1在心肌組織中的定位情況，采用免疫組織化學進行了檢測。實驗結果發現，陽性信號呈棕褐色顆粒，主要定位于細胞包漿中，部分定位于線粒體，與線粒體的排列位置相一致，呈珠串狀，且在db/db糖尿病心肌組織中表達明顯低于健康組(圖3)。

3 討論

糖尿病心肌病已日益成為嚴重危害人類健康的疾病，它的發生及發展是一個十分復雜的過程，近年來已逐漸成為人們關注和研究的熱點。最近有研究認為，糖尿病心肌病的發生與線粒體功能的紊亂直接相關[4]。Drp1通過對線粒體分裂與融合的調控，影響線粒體的生物學功能。有研究[7]發現，在心肌細胞中，Drp1在氧化應激過程中，通過調節其表達進一步調控線粒體的分裂融合。有研究[8]發現，Drp1與心肌細胞的衰老具有明顯的相關性。但Drp1在糖尿病心肌病中的作用及其機制尚不十分清楚。

本研究以db/db糖尿病小鼠為糖尿病心肌病疾病模型，首先檢測了Drp1 mRNA的表達水平，結果發現db/db糖尿病小鼠心肌組織中Drp1 mRNA水平明顯低于健康組，且與小鼠的周齡呈明顯的負相關。為了進一步確認這一實驗的準確性，采用Western Blot對Drp1的蛋白表達進行了檢測，結果提示與實時定量PCR的結果相一致。免疫組織化學法發現，Drp1主要表達于胞漿，少數表達于線粒體，其排列方式與線粒體在細胞中的分布相一致。

綜上認為，在糖尿病心肌病的發生及發展過程中，Drp1的表達呈明顯的進行性降低，這種改變可能導致線粒體的分裂與融合的平衡被打破，使線粒體的生物學功能障礙，如ATP的生成改變，膜電位的改變以及ROS的生成改變等，從而最終導致糖尿病心肌病的發生及發展。但由于實驗條件的限制，本實驗僅僅是對糖尿病大鼠心肌Drp1的表達及定位進行了初步研究，并未對其進行深入研究，這也導致了本研究具有一定的局限性。因此，根據本實驗的結果，我們將在后續研究中，對Drp1在糖尿病心肌病中發揮作用的具體分子機制進行更深層次的研究與探討，以期為糖尿病心肌病的治療提供潛在的治療靶點。

(本文圖1～3見封三)

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Expression of Drp1 in heart of diabetic mice

JingZhe*,LiuFengzhou,ChenYongqing,LiuYan,ChenChong,JingCe

(*DepartmentofCardiology,LanzhouGeneralHospital,LanzhouMilitaryRegion，Lanzhou730050，China)

Objective To observe the expression of Drp1 in the cardial muscle tissue of diabetic mice and normal mice.Methods Nine male db/db mice were randomly divided into 3 groups(db/db 6week group, db/db 12week group and db/db 18week group). Nine male normal mice were randomly divided into another 3 groups(wt 6week group, wt 12week group and wt 18week group). The expression of Drp1 was detected by real-time PCR, Western Blot and immunohistochemical. Results Compared to the normal group, the expression of Drp1 was decreased obviously in db/db mice group, and was gradually decreased with age. Conclusions The decreased expression of Drp1 maybe is one of the possible mechanisms of diabetic cardiomyopathy.

Diabetes mellitus,type 2；Myocardium；Dynamin I ；Mitochondria,heart；Mice inbred DBA

荊哲，醫師，Email：35082774@qq.com

R587.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.022

2016-01-04)