EDTA依賴性血小板假性減少的實驗分析及應對措施

黃朝任,鄒光美

1.玉林市中醫院檢驗科，廣西玉林537000;2.玉林市第一人民醫院檢驗科，廣西玉林537000

EDTA依賴性血小板假性減少的實驗分析及應對措施

黃朝任1,鄒光美2

1.玉林市中醫院檢驗科，廣西玉林537000;2.玉林市第一人民醫院檢驗科，廣西玉林537000

目的分析使用血細胞分析儀檢測血小板計數出現假性減少的原因及復查方法。方法根據該實驗室復檢標準，采用血小板出現假性減少的50例門診或住院患者作為研究對象，分析假性減少的原因及其復查方法。結果50例血小板假性減少樣本中，42例為乙二胺四乙酸依賴性，3例為大血小板，2例白細胞周圍衛星現象，3例冷凝集現象,對這些患者進行復查后可得到正常范圍的血小板結果。結論EDTA-PTCP患者經鏡檢涂片發現聚集現象，可用枸櫞酸鈉抗凝、無抗凝劑即刻上機、手工計數復查血小板數值以避免誤診。

血小板計數；血小板聚集；血小板假性減少；EDTA

(Pseudo thrombocytopenia，PTCP)是一種體外多病因的現象，包括抗凝相關的血小板凝集、大血小板、血小板衛星現象、冷凝集、微小的凝塊等。乙二胺四乙酸（EDTA）是臨床實驗室廣泛應用于全血細胞計數及分類的一種最理想抗凝劑，同時也是引起血小板聚集而假性減少最常見的原因。乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少（EDTA-PTCP）導致血細胞計數儀無法準確計數而出現血小板數量減少或明顯減少現象，據文獻報道[1]其發生率為0.09%～0.21%。檢驗出現假性減少結果會造成臨床患者的誤診、誤治，可能給患者造成不必要的骨髓穿刺和不恰當的治療，如輸注血小板，激素，甚至脾切除等[2]。此種假性PLT減少一般不需要治療，但在實際臨床工作中需要與真性血小板減少相鑒別，通過檢驗科人為手段進行對患者的血常規進行特殊流程處理及糾正PLT結果，可以減少患者不必要的輔助檢查和治療，因此研究EDTA-PTCP正確的診斷方法來提高檢驗人員血小板計數的準確性的能力，避免誤導臨床醫生對患者的診斷和治療具有非常重要的意義。該研究報道近2年42例發現為EDTA-PTCP患者的實驗室結果分析及應對措施報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有血常規標本來自該院2014年6月—2016年6月門診及住院患者。于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的真空管中靜脈采血2 mL，充分混勻后在血細胞分析儀上按程序進行檢測,按本科室標準操作規程（SOP）文件的復檢規則，對血小板低于70×109/L的標本進行手工涂片復檢，發現血小板明顯凝集現象均重新抽血復查。共收集50例EDTA所致的假性血小板減少病例，其中男32例，女18例，年齡1～74歲，平均36歲。ICU科3例，婦產科4例，兒科7例，風濕科3例,呼吸內科4例，消化內科2例，神經內科2例，腎內科1例，心內科2例，血液科8例，外科7例，門診/急診7例。其中42例EDTA依賴性致血小板假性減少癥，3例聚集的為大血小板患者，2例血小板衛星現象，3例為冷凝集誘發的聚集。

1.2 儀器與試劑

采用希森美康血細胞分析儀（SysmexXT4000i），試劑為希森美康專用血球原裝配套試劑試劑和相關質控品。用(OLYMPUS CX31)顯微鏡油鏡下觀察PLT聚集分布和形態。

1.3 標本采集

用EDTA-K2抗凝采集2 mL全血充分混勻,實驗前儀器室內質控在控且標本測定在1 h內完成。對符合篩選標準的患者標本，排除標本凝固問題和檢測隨機誤差外，對確認血小板聚集的患者再次采集枸櫞酸鈉抗凝和無抗凝劑各1管。該研究所用真空采血管均由湖南省瀏陽市醫用科技發展有限公司提供。

1.4 涂片染色鏡檢及手工稀釋計數

EDTA抗凝全血涂片后用瑞氏-姬姆薩染液(自配)染色及鏡檢；手工稀釋計數為在清潔試管中加入稀釋液0.38 mL草酸銨(自配)加準確吸取20 μL無抗凝劑全血,進行手工計數血小板,方法均依據《全國臨床檢驗操作規程》第3版[3]。

1.5 統計方法

處理采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，檢測值以均數±標準差±s)表示；4種復查方法學差異性比較采用配對t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。

2 結果

EDPA依賴性致血小板假性減少癥（EDTA-PTCP）共有42例。該42例標本首次采血后上機檢測結果血小板計數均低于80×109/L，取EDTA采樣的抗凝血涂片染色后鏡檢，低倍鏡下可見血小板聚集，成團或成小堆存在，油鏡下可見數量較多的血小板聚集現象。對此患者當場抽血2管，未加任何抗凝劑管立即上機檢測，枸櫞酸鈉抗凝管2 min之內上機檢測，結果均在正常范圍，與手工計數結果一致，均與首次上機檢測結果比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。用SPSS軟件對復查方法進行配對t檢驗結果顯示，枸櫞酸鈉抗凝與即刻上機復查，差異有統計學意義（P=0.021＜0.05），即刻上機復查與手工計數復查，差異有統計學意義（P=0.042＜0.05）。

2.2 其他原因組的結果分析

大血小板致血小板計數減少共3例，首次上機檢測及枸櫞酸鈉抗凝復查血小板結果均低于50×109/L，血細胞分析儀血小板直方圖2例出現聚集報警。涂片鏡下觀察，易見大血小板或較大血小板有聚集現象。手工計數或未加抗凝劑抽血立即上機后結果正常，與涂片估算結果較一致。血小板衛星現象共2例，1例為儀器聚集報警，油鏡下觀察可見血小板附在中心性分葉核白細胞周圍，手工計數結果在正常范圍。冷凝聚3例，首次結果均未能檢測，將該標本至37℃水浴30 min后上機檢測，血小板的結果在正常范圍；另外枸櫞酸鈉及無抗凝劑均在37℃水杯中進行上機檢測，結果均有低于100×109/L，儀器血小板未見聚集提示，手工計數結果均在正常范圍。

表1 血小板假性減少原因分析及4種方法檢測結果（±s）

表1 血小板假性減少原因分析及4種方法檢測結果（±s）

注：－表示無數據；血小板計數單位為×109/L。

原因例數EDTA抗凝結果枸櫞酸鈉抗凝結果無抗凝劑（即刻上機）結果（×109/L）手工計數結果EDTA-PTCP大血小板血小板衛星現象冷凝聚42 323 56.5±16.28 32.33±8.14 52.5±6.36 -201.55±45.34 33.33±1.53 157.50±10.61 80.0±15.72 207.95±48.77 157.67±13.87 176.50±17.68 76.0±9.85 206.62±48.14 151.68±12.58 171.0±15.56 198.0±26.2

2.3 血小板直方圖及警報提示信息進行分析

對首次EDTA抗凝檢測結果中血小板直方圖出現翹尾，警報框出現“血小板聚集？”等為有聚集提示，結果發現EDTA-PTCP組76.2%的血小板假性減少在血細胞分析儀上可出現聚集報警，見表2。采用χ2檢驗，計算得出，差異有統計學意義（χ2=12.77，P＜0.05）。

表2 血小板假性減少在血常規儀器上聚集提示報警情況

3 討論

在該院2014年6月—2016年6月期間住院的26 923例患者，在他們進行血常規分析中發現42例EDTA -PTCP病例，其發生率為0.156%。與文獻報道[1,4]的發生率基本一致。該研究篩查患者血小板計數低于70×109/L的病例，同時對其進行了血小板直方圖觀察和顯微鏡檢查有無聚集?？赡苈z一些血小板檢測數量較高即使因EDTA原因聚集卻未降至70×109/L以下的病例，推測實際發生率可能會更高。排除血小板減少癥患者，已經有學者[5]提出了幾種方法來防止血小板凝聚，如使用替代抗凝劑包括枸櫞酸鈉、肝素等。從該文表1結果表明，42例EDTA-PTCP可以用枸櫞酸鈉抗凝或無抗凝劑抽血立即上機可以加以糾正，其糾正數值手工計數結果相接近，與馮戟等[6-7]研究結果一致。用配對t檢驗比較4種檢測血小板的均值（P＜0.05），結果表示EDTA抗凝與枸櫞酸鈉抗凝劑、無抗凝劑即刻上機及手工計數檢測血小板數值均有顯著性差異。對于使用枸櫞酸抗凝計數血小板標本盡快檢測對結果影響較少，與Lin J等[4]研究要求在10 min內檢測要求相近。另外該研究發現2例大血小板聚集患者對枸櫞酸鈉也發生聚集現象，有研究報道[8]枸櫞酸鈉抗凝血也可引起PLT計數假性減少，但對其引起血小板假性減少的機制尚不清楚。該研究中42例EDTA-PTCP患者標本EDTA抗凝上機PLT直方圖90.5%提示聚集報警，但血涂片均見PLT明顯聚集現象。大血小板、血小板衛星現象及冷凝集素引起血小板假性減少現象較少見，病例數非常有限，儀器提示聚集報警率較低37.5%。其中2例大血小板患者中使用枸櫞酸鈉抗凝，檢測結果仍很低，經涂片血小板發現也有5～10個聚集情況，其發生機制也不明確。

EDTA-PTCP的發病機制比較復雜，目前病理生理尚不十分清楚。EDTA誘導PTCP在1969年首次由Gowland等人報道，根據Lin J等或Shabnam I等的研究[4,9]提及Ca2+的螯合作用可以使Ca2+依賴的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，由于EDTA表面糖蛋白和陰離子磷脂引起的改變，在抗血小板抗體結合的作用下誘導血小板聚集。有學者[2]推測可能是某些EDTA-PTCP患者血漿存在自身抗體抗、抗心磷脂抗體、血小板抗體以及血小板表面可能存在的某些與聚集相關隱匿性抗原等，導致血小板發生聚集。有學者研究表明EDTA-PTCP患者血小板聚集與EDTA抗凝時間及室內溫度有關，時間越長溫度越低現象越頻繁。另外對EDTA-PTCP患者的危險因素已被廣泛研究，住院治療，藥物治療或潛在的疾病被認為是增加EDTA-PTCP患者危險因素[10]。Saigo K等的綜述研究[11]提及EDTA-PTCP患者可能與自身免疫性疾病，病毒和細菌感染、慢性肝疾病，代謝綜合征，惡性腫瘤等疾病有關，然而沒有研究明確具體的疾病和EDTA-PTCP患者的發生密切相關。

對EDTA-PTCP患者誤診的可能存在以下原因：①血小板減少的復查制度及處理流程不夠完善；②科員對血涂片鏡檢及手工計數血小板的能力有待提高；③住院患者血常規標本采集到上機檢測的時間較長，導致血小板聚集更顯著；④部分檢驗人員及臨床醫生對EDTAPTCP認識不足、重視不夠，兩者可能溝通不到位等。因此必須提高醫務人員對EDTA-PTCP患者的應對策略，具體措施如下：①本科室的血小板減少的復查制度：PLT＞1 000×109/L或PLT＜70×109/L或儀器提示血小板聚集及血小板直方圖有翹尾異常均要涂片鏡檢復查。該科室處理流程為對于鏡檢血小板有聚集疑似EDTAPTCP患者，首先查看標本質量是否合格，是否出現凝塊；同時查看儀器提示警報是否出現提示PLT聚集及PLT直方圖異常；第二與臨床醫生或患者溝通是否出現皮膚紫癜、淤點淤斑、牙齦出血、鼻出血、胃腸道出血等PLT減少病癥，當血小板減低與患者臨床癥狀或病史不符則必須涂片染色鏡檢[10]；第三顯微鏡觀察血小板分布情況，如易見血小板成團或成小堆聚集則通知患者重新采血手工計數復查或重新抽血無抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝的真空管立即上機復查3種方法選其中一進行復查，必要時選兩種）。②加強科員對PLT鏡檢及手工計數的檢驗能力，重要的是識別血小板計數假性減少的能力，初步結合儀器報警提示、PLT直方圖、血涂片鏡檢綜合分析及時有效處理，避免患者不必要的治療。③檢驗人員提高工作責任心，高度重視PLT假性減少病例，加強與臨床醫患人員溝通交流。④對于出現冷凝集素、大血小板、血小板衛星現象所引起的血小板假性減少，可進行草酸銨法手工計數血小板進行糾正更為準確[12]。手工計數法是血小板測定的參考方法，雖然精密度與儀器相比較差，但可計數2～3次取均值來減少實驗誤差，是對血小板假性減少的復查中一種經典有效的方法。⑤用枸櫞酸鈉抗凝劑或無抗凝劑立即上機進行血小板計數復查，可能檢測結果與手工計數結果存在一些差異，同時不能作為結果報告僅供檢驗人員復查參考，但其對于排除EDTA-PTCP引起的血小板假性減少也是可行的快捷方法。

綜上所述，當出現血小板計數結果減少、儀器有報警提示或者PLT直方圖有異常時，檢驗人員應引起足夠重視，采取相應的措施進行全面、綜合的復查處理，避免發出錯誤檢驗結果，必須為臨床醫患人員提供正確可靠的檢驗報告，減少醫療糾紛構建和諧醫患關系。但目前EDTA-PTCP發生的機制不是很明確[4]，如抗血小板抗體產生的關鍵因素，血小板在受EDTA抗凝劑作用后的變化機制，EDTA誘導血小板聚集與抗凝時間、溫度還沒有很好的定論，為何這種聚集現象只發生在極少數人，與疾病、用藥、機體本身抗體或相關生化免疫指標有何關聯等都有待進一步探討研究。

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Experimental Analysis and Countermeasures of Edta-dependent Pseudo-reduction of Platelet

HUANG Chao-ren1,ZOU Guang-mei2
1.Department of Clinical Laboratory,the Traditional Chinese Medicine of Yulin City,Yulin,Guangxi Province,537000 China；2.Department of Clinical Laboratory,the First People’s Hospital of Yulin City,Yulin,Guangxi Province,537000 China

ObjectiveTo analyze the cause and reexamination method of pseudo-reduction of platelet by the blood cell analyzer.Methods50 cases of patients with pseudo-reduction of platelet were selected as the research objects according to the reexamination standards,and the causes and reexamination method were analyzed.ResultsIn the 50 cases of samples, Ethylenediaminetetraacetic acid–dependent occurred to 42 cases,giant platelet occurred to 3 cases,and white blood cell satellite phenomenon occurred to 2 cases,and cold agglutination occurred to 3 cases,and the platelet results within the normal range could be obtained after reexamination.ConclusionThe gather phenomenon is found in patients with EDTA-PTCP after the microscopy smear,and the platelet figure can be reexamined by the manual counting to avoid the misdiagnosis.

Platelet count;Platelet aggregation;Pseudo-reduction of platelet;EDTA

R55

A

1672-5654（2016）12（b）-0049-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.35.049

2016-09-14）

黃朝任（1981.2-），男，壯族，廣西南寧人，本科，主管技師，主要從事臨床生化及血液研究工作。