家蠅幾丁質結合蛋白(Md-CBPⅠ)的表達純化及活性分析

袁野，閆恕，張丹丹，孔令聰，裴志花，劉樹明，馬紅霞,2*

(1. 吉林農業大學，動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林農業大學，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

家蠅幾丁質結合蛋白(Md-CBPⅠ)的表達純化及活性分析

袁野1，閆恕1，張丹丹1，孔令聰1，裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

(1. 吉林農業大學，動物科學技術學院，長春 130118；2.吉林農業大學，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

為了研究家蠅幾丁質結合蛋白(Md-CBPⅠ)在家蠅防御體系中的相關活性，采用PCR技術，對從雞源沙門氏菌誘導家蠅幼蟲構建的抑制性消減文庫(SSH)中篩選到的家蠅幼蟲幾丁質結合蛋白Ⅰ基因(Muscadomesticachitin binding proteinⅠ,Md-CBPⅠ)進行擴增，并成功構建了重組表達質粒pET-32a-Md-CBPⅠ，于大腸桿菌BL21(DE3)中得以高效表達，純化并獲得了Md-CBPⅠ融合蛋白。進一步對該蛋白的親和活性進行了研究，發現Md-CBPⅠ融合蛋白對幾丁質以及纖維素均有一定的結合作用，且其對幾丁質的結合作用相對較好。試驗為家蠅幾丁質結合蛋白生物學活性和免疫學活性的研究奠定了基礎。

家蠅;幾丁質結合蛋白;克隆;原核表達

家蠅長期處于病原菌叢生的環境中，但卻不易被其所感染，根源在于其體內所產生的多種抗菌物質[1]，幾丁質就是其產生的眾多抗菌物質中的一種。在昆蟲體內幾丁質與幾丁質結合蛋白結合成為一種特殊的復合體:幾丁質蛋白復合體，從而對外界損傷、攝入毒素以及病原體感染起著重要的防御作用[2-3]，該復合體也是昆蟲體壁重要的組成部分，二者的缺失將會導致表皮功能異常甚至喪失，并且對昆蟲的生長，體態協調，變態發育，繁殖能力有很大的影響。此外，一部分幾丁質結合蛋白還具有抗細菌、抗真菌和抗病毒活性[4]。由此可見，幾丁質結合蛋白在家蠅防御體系中起著不可或缺的作用，但該蛋白的相關活性還有待深入研究。

為此，本研究以雞源沙門氏菌誘導家蠅三日齡幼蟲抑制性消減文庫中篩選出來的差異基因為基礎，對家蠅幾丁質結合蛋白Ⅰ基因進行克隆及原核表達，并對其親和活性進行了檢測，為該蛋白的深入研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫、菌種及表達載體 雞源沙門氏菌誘導家蠅三日齡幼蟲SSH文庫及5'RACE-Ready cDNA由吉林農業大學獸醫藥理與毒理學實驗室完成[5]，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)以及原核表達載體pET-32a(+)由吉林農業大學獸醫藥理與毒理學實驗室保存。1.1.2 主要試劑及工具酶 Ex Taq 酶，dNTP，限制性內切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)，T4 DNA連接酶，DNA Marker(DL2000，λ-HindⅢdigest)，pMD18-T Vector，寶生物工程(大連)有限公司；異丙硫代β-D半乳糖苷(IPTG)，氨芐青霉素(AMP)，北京鼎國有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；其余試劑均為國產分析純試劑。1.1.3 引物合成和DNA測序 引物的合成和重組質粒DNA測序由博仕生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1Md-CBPⅠ的篩選及全長基因的克隆 從本實驗室構建的雞源沙門氏菌誘導家蠅三日齡幼蟲SSH文庫中篩選獲得家蠅差異表達序列Md-CBPⅠ，該序列與GenBank中登陸號為LOC105262293的序列相似度為98%。根據Md-CBPⅠORF序列剪掉信號肽，并用Primer5.0軟件設計全長PCR引物(表1)。

表1 Md-CBPⅠ基因的全長引物設計

以家蠅三日齡幼蟲5'-RACE-Ready cDNA為模板進行PCR擴增，將PCR產物純化后連接至pMD18-T Vector(命名為pMD18-T-Md-CBPⅠ)并轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，隨機挑取單克隆菌落，提取質粒并雙酶切鑒定，將陽性克隆的菌液送至博仕生物工程股份有限公司進行測序。1.2.2 生物信息學分析方法 采用ExPASy的在線軟件Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)預測Md-CBPⅠ編碼蛋白的理化性質，對其序列進行分析；采用MEGA軟件進行多重序列比對分析，并使用臨位法構建了系統進化樹；運用EMBL工具Pfam(http://pfam.xfam.org/search/)對該基因的保守區完整性進行鑒定；根據cuticleDB 數據庫的Hidden Markov Modeling 軟件(http://bioinformatics2.biol.uoa.gr/cuticleDB/index.jsp)，預測了Md-CBPⅠ所屬的表皮蛋白家族；通過Prosite軟件(http://prosite. expasy.org/)，預測了Md-CBPⅠ基因所含有的磷酸化及糖基化等功能性位點；利用PSIPRED軟件(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，對本基因的二級結構進行了預測并分析。

1.2.3 重組表達質粒的表達與純化 將測序驗證后的陽性克隆子和原核表達載體pET-32a(+)經限制內切酶雙酶切回收后，用T4 DNA連接酶進行連接。將連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，隨機挑取單克隆菌落提取質粒進行PCR及雙酶切鑒定，將陽性克隆菌液進行測序驗證。將測序正確的重組表達質粒pET-32a-Md-CBPⅠ轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，挑取陽性克隆的單克隆菌落至LB(Amp)培養液中，1% IPTG誘導表達，誘導4 h時收集菌體超聲破碎，分別取上清和沉淀進行分析，處理后的產物經蛋白電泳SDS-PAGE(15%)進行分析。

將以上步驟處理后的上清液加入到經過Wash Buffer(50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，PH 8.0)平衡過后的鎳離子親和層析柱中，冰上結合2 h后收集流出液。分別用20 mL Wash Buffer平衡，200 mL Elution Buffer(10 mM-200 mM Imidazole，50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，PH 8.0)梯度洗脫，收集洗脫液。分別將20 μL流出液以及各個梯度的洗脫液處理后經蛋白電泳SDS-PAGE(15%)進行分析。

1.2.4 pET-32a-Md-CBPⅠ融合蛋白的親和性質分析 各取2 mL幾丁質珠和2 mL纖維素(經結合緩沖液處理過夜)入層析柱，將使用結合緩沖液處理后的蛋白以3倍體積加入到以上層析柱(室溫孵育3 h)并收集流出液。分別用洗滌緩沖液洗滌5次，每次孵育15 min，收集每次的流出液，最后用8 M尿素洗脫，收集洗脫液。分別將20 μL流出液以及洗脫液處理后經蛋白電泳 SDS-PAGE(15%)進行分析[6-7]。

1.2.5 生物活性檢測 利用牛津杯法，分別檢測純化后的融合蛋白對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌的生物活性。取100 μL菌液(105CFU/mL) 均勻涂布于瓊脂平板上，放入牛津杯，杯內加入純化后的融合蛋白(4 μg/μL)，37 ℃過夜培養，觀察抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1Md-CBPⅠ全長基因的擴增及克隆Md-CBPⅠ經PCR擴增后獲得348 bp大小的條帶。將純化產物與pMD18-T載體連接，限制性內切酶雙酶切驗證和測序驗證均為陽性，證明pMD18-T-Md-CBPⅠ構建成功。Md-CBPⅠ全長ORF基因PCR擴增和pMD18-T-Md-CBPⅠ雙酶切鑒定(圖1)。

M：DNA分子量標準DL2000；1：重組質粒Md-CBPⅠ的全長PCR產物；2：重組質粒pMD18-T- Md-CBPⅠ的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切圖1 Md-CBPⅠ全長ORF基因PCR擴增和pMD18-T- Md-CBPⅠ雙酶切鑒定

2.2 生物信息學分析

2.2.1 序列分析 全長序列分析顯示該基因全長為570 bp，ORF為393 bp，剪掉信號肽后為348 bp，共編碼114個氨基酸。預測后的等電點為5.63，預測分子量約為14.1 kD。帶正電殘基(Arg+Lys)為8，帶負電殘基(Asp+Glu)為33。該蛋白的不穩定系數為9.19，說明該蛋白很穩定。脂肪指數為37.54，親水性系數為-2.031，說明該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 基因的同源性及系統進化樹構建 系統進化樹分析表明Md-CBPⅠ與家蠅其它表皮蛋白和廄螫蠅表皮蛋白親緣關系較遠(圖2)。

2.2.3 編碼蛋白結構域預測 通過保守區鑒定后，結果顯示，Md-CBPⅠ編碼的蛋白質在57-108位氨基酸處含有Chitin-Bind 4保守基序，該保守基序作為幾丁質結合位點的R-R保守區域的擴展版本，為此，可以確定該家族為昆蟲表皮蛋白，屬于CPR家族(圖3)。

相關軟件預測顯示Md-CBPⅠ編碼的蛋白質屬于表皮蛋白 RR-1亞族。該亞族存在于柔軟表皮層中，與預測中幼蟲表皮蛋白基因相符。

Prosite分析表明，該基因在102-105位氨基酸處含有磷酸化位點。可能與Md-CBPⅠ編碼的蛋白質的功能密切相關。

圖2 Md-CBPⅠ與蠅類其它表皮蛋白的系統進化分析

圖3 Pfam對Md-CBPⅠ的保守區分析

2.2.4 編碼蛋白二級結構分析 β-折疊是表皮蛋白-幾丁質相互作用所必需的基本結構[12]，二級結構預測結果顯示，在幾丁質結合區域中β-折疊的比率高達60.7%，無α-螺旋結構(圖4)。

圖4 Md-CBPⅠ的二級結構預測

2.3 重組表達質粒的表達與純化 將重組表達質粒通過PCR及限制性內切酶雙酶切驗證，在約348 bp處有一條清晰的條帶，與目的基因大小相符(圖5)。通過測序驗證，成功構建了重組表達質粒pET-32a-Md-CBPⅠ。

M：DNA分子量標準DL2000；1：重組質粒pET-32a-Md-CBPⅠ的PCR鑒定；2：pET-32a-Md-CBPⅠ雙酶切圖5 重組質粒pET-32a-Md-CBPⅠ的PCR及雙酶切鑒定

取重組菌誘導前后的表達產物以及破碎后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，誘導的重組菌約在40 kD左右出現表達帶，而未誘導菌無此條帶(圖6)，說明融合蛋白成功獲得表達；對其可溶性行進分析，結果顯示融合蛋白主要在上清中表達，屬于可溶性表達；對融合蛋白進行純化，并將純化后的蛋白經過蛋白電泳SDS-PAGE檢測，在約40 kD大小處得到單一條帶，表明獲得較高純度的融合蛋白(圖6)。

2.4 親和性質分析 將流出液以及洗脫液通過蛋白電泳SDS-PAGE分析后顯示，與幾丁質和纖維素結合的蛋白大小在40 kD左右，與目的蛋白大小一致(圖7)(為保證體外親和試驗的特異性，結合緩沖液含有較高的鹽離子濃度，并通過洗滌緩沖液反復洗滌，除去非特異性結合的蛋白[11])。在上樣量保持相同的條件下，幾丁質親和實驗中洗脫液的濃度相對較高，結果顯示，純化后的融合蛋白均可以與幾丁質以及纖維素特異性結合，且融合蛋白對幾丁質的結合能力要比纖維素高。

M：低分子量蛋白Marker；1：E.coli BL21/pET-32a誘導后；2:E.coli BL21/pET-32a-Md-CBPⅠ誘導后；3:E.coli BL21/pET-32a-Md-CBPⅠ誘導4 h后；4-5：pET-32a-Md-CBPⅠ超聲破碎后上清及沉淀；6：純化后的融合蛋白圖6 重組質粒pET-32a-Md-CBPⅠ表達產物及融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

板塊A：幾丁質; 板塊B：纖維素；M：低分子量蛋白Marker; 1.融合蛋白; 2.流出液; 3.第一次洗滌組分;4.最后一次洗滌組分; 5.洗脫液溶出的融合蛋白圖7 pET-32a-Md-CBPⅠ融合蛋白親和性質分析結果

由于原核表達的融合蛋白結合能力較弱，所以將洗脫液的組分濃縮。泳道5為濃縮20倍后的結果。

2.5 生物活性檢測 經檢測純化后的融合蛋白對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌均無抑菌活性。

3 討論

幾丁質是家蠅眾多抗菌物質中的一類，家蠅體內含有大量高純度的幾丁質，而幼蟲表皮和蛹殼是提取幾丁質的主要原料，其中蛆殼中的幾丁質含量達95%以上[8-9]。近年來，國內外學者已對家蠅幾丁質的作用有了一定的了解，但對其編碼基因以及防御、免疫等方面的研究才剛剛起步。本研究以雞源沙門氏菌誘導家蠅三日齡幼蟲抑制性消減文庫中篩選出來的差異基因為基礎，對家蠅幾丁質結合蛋白Ⅰ基因進行克隆及原核表達，并對表達產物進行親和性質分析。

根據序列分析顯示，Md-CBPⅠ屬于CPR家族，該家族是因含有R&R保守區而命名的，是節肢動物中最大的表皮蛋白家族。目前，該家族中的幾種昆蟲已經成功獲得全基因組序列，其中對果蠅、岡比亞按蚊、西方蜜蜂、家蠶、金小蜂和赤擬谷盜的表皮蛋白基因已經進行了詳細的人工標注[10]。

本文首次報道了含有R&R保守序列的擴展版本chitin_bind_4的家蠅幾丁質結合蛋白。通過信號肽預測軟件，發現Md-CBPⅠ基因含有一個包含17個氨基酸殘基的信號肽序列，其為表皮蛋白的常見特征。Md-CBPⅠ基因屬于表皮蛋白的RR-2亞家族，該家族對昆蟲表皮的硬化起著關鍵的作用，且其編碼的氨基酸序列中，含有大量的組氨酸和賴氨酸，相關研究證明，這兩種氨基酸在硬化反應中也具有一定意義[11-12]。通過對構建的進化樹我們發現，Md-CBPⅠ與家蠅其它表皮蛋白和廄螫蠅表皮蛋白親緣關系較遠。但其功能是否與其他表皮蛋白有差異，還有待于進一步研究。

此外，試驗進一步對該蛋白的親和活性進行了研究，發現其對幾丁質以及纖維素都有一定的結合作用，顯示了該蛋白對多糖底物的結合能力。相關文獻顯示，幾丁質結合蛋白結合多糖底物的能力可能賦予了該蛋白抗菌、抗真菌以及抗病毒活性[13-14]。試驗采用的是大腸桿菌原核表達系統，大腸桿菌的胞質環境是高度還原的，所產生的蛋白并不包含穩定的二硫鍵，而二硫鍵是幾丁質結合蛋白的一個重要特征，這可能是Md-CBPⅠ融合蛋白無抑菌活性的原因。而Md-CBPⅠ是否含有抗真菌以及抗病毒活性，或在真核表達系統中是否含有相應的活性還有待進一步研究。這也驗證了篩選自雞沙門氏菌誘導后構建的SSH文庫中的Md-CBPⅠ基因，其在誘導后表達量的增加可能對家蠅對沙門氏菌的耐受起著重要的作用。

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(編輯：陳希)

Expression，Purification and Activity Analysis of Chitin Binding Protein(Md-CBPⅠ)fromMuscadomestica

YUAN Ye1,YAN Shu1,ZHANG Dan-dan1,KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1,LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to research the activities ofMd-CBPⅠ in musca domestica defence system,Md-CBPⅠwas screened from suppression subtractive library(SSH) inMuscadomesticalarvae induced bySalmonellapullorumof chickens and also amplified by PCR techniques. The recombinant expression plasmid of pET-32a-Md-CBPⅠ was constructed successfully and expressed inE.ColiBL21(DE3). fusion protein was obtained by purification, further more, the preliminary study was made on the affinity of which revealed that the fusion protein has binding affinity of both chitin and cellulose, and the affinity of chitin was stronger than cellulose. This research laid a foundation for further research on biological activity and immunological activity ofMd-CBPⅠ.

Muscadomestica; chitin binding protein; clone; prokaryotic expression

國家自然科學基金資助項目(31572574，31502121)；吉林省世行貸款農產品質量安全項目(2011-Y05)

2015-11-04

A

1002-1280 (2016) 01-0008-06

S852.65