一株歐亞類禽H1N1豬流感病毒分子特征分析

趙化陽，王金亮，劉金華，許冠龍，侯東軍，文晶亮，邢佳鵬，鄭杰，張連祥

(1.華都集團北京市獸醫生物藥品廠，北京102209；2.中國農業大學動物醫學院，北京100193；3.中國動物疫病預防控制中心，北京100125)

一株歐亞類禽H1N1豬流感病毒分子特征分析

趙化陽1，王金亮2，劉金華2，許冠龍2，侯東軍3，文晶亮1，邢佳鵬1，鄭杰1，張連祥1

(1.華都集團北京市獸醫生物藥品廠，北京102209；2.中國農業大學動物醫學院，北京100193；3.中國動物疫病預防控制中心，北京100125)

為調查國內豬流感病毒流行和遺傳演化狀況，將2013年從山東某屠宰場的采集樣品接種SPF雞胚，分離到1株病毒，通過RT-PCR鑒定和全基因測序，并運用生物軟件對病毒基因組關鍵氨基酸位點和遺傳演化關系進行分析。結果顯示，分離株A/Swine/Shandong/5513/2013 (H1N1)為歐亞類禽H1N1豬流感病毒，基因片段未發生重排，與中國大陸近幾年分離株類似。HA蛋白受體結合位點具有結合哺乳動物氣管上皮細胞特性；HA蛋白抗原位點與歐亞類禽H1N1豬流感代表株A/swine/Hong Kong/1780/2008(H1N1)僅有一處不同，Q196H；裂解位點氨基酸為PSIQSR/GL，PB2蛋白毒力關鍵氨基酸位點為T271和E627，分離株為典型低致病力毒株。本毒株的分離鑒定為分析中國大陸豬流感流行狀況和分子特征提供了數據。

H1N1豬流感病毒；歐亞類禽；分子特征

一般認為豬是流感病毒的基因“混合器”，其氣管上皮細胞既有α-2,3-Sias受體，又具有α-2,6-Sias受體，既可感染禽流感病毒，又可以感染人類流感病毒，在A型流感病毒變異重排和傳播中發揮重要作用[1]。目前，全球豬群流行著H1N1, H1N2和H3N2等亞型流感病毒[2]。其中，經典H1N1豬流感首次在1918年分離到[3]，歐亞類禽H1N1豬流感病毒首次分離于1979年[4]。近些年，歐亞類禽H1N1豬流感病毒在中國大陸豬群逐步蔓延[5-6]，在歐洲及中國造成多起人類感染病例，且有一例死亡病例[7]，而且該類型病毒多數可以通過飛沫在哺乳動物(雪貂)模型中有效傳播[8]，對人類健康構成較大威脅，因此監測和研究歐亞類禽H1N1豬流感病毒具有重要的公共衛生學意義。本研究對2012-2013年流感季分離鑒定的一株歐亞類禽H1N1豬流感病毒進行遺傳演化和分子特征進行分析，為豬流感的防控提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 毒株的分離與鑒定 2013年1月，從山東某屠宰場共采集豬咽喉棉拭子樣品600份，樣品經青鏈霉素PBS緩沖液處理，冷藏運輸至實驗室。接種10日齡SPF雞胚，3 d后收集尿囊液，用1%雞紅細胞檢測血凝活性，血凝陰性的樣本，盲傳2代，再次檢測血凝性。具有血凝性的樣品，提取核酸，進行RT-PCR方法鑒定。

1.2 病毒基因序列測定 豬流感病毒引物設計和RT-PCR擴增方法參照已有文獻[6,9]。引物由上海生工公司合成，PCR產物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3 病毒的遺傳進化與分子特征分析 應用NCBI網站資源對分離株基因序列進行同源性比對；采用MEGA6.0 軟件進行進化分析并繪制進化樹，算法采用Neighbour-joining 法， Bootstrap 值選擇 1000 重復；并使用 MEGA6.0 將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，然后對氨基酸序列進行流感病毒分子特征分析[5]。

2 結果

2.1 SIV病毒的分離鑒定與命名 采集樣品經病毒分離、RT-PCR鑒定及序列比對，確認分離1株H1N1亞型豬流感病毒，命名為A/Swine/Shandong/5513/2013 (H1N1)(簡稱SW/SD/5513/13)。

2.2 病毒的遺傳進化分析 在NCBI網站下載豬流感病毒代表性毒株基因序列，通過與分離株進行基因比對，分析其遺傳進化關系。結果表明，SW/SD/5513/13的HA基因屬于歐洲類禽H1N1流感病毒分支，與近些年在大陸和香港豬流感病毒遺傳關系較接近(圖1)。NA及其他6個內部基因進化樹比對結果顯示，均未發生基因重排。

▲代表分離毒株-A/Swine/Shandong/5513/2013 (H1N1)圖1 EA H1N1 SIV分離株HA基因進化樹

2.2.1 病毒的同源性分析 分離的SW/SD/5513/13毒株測序結果經NCBI BLAST，發現8個基因片段均處于歐亞類禽進化分支，與近期歐洲及亞洲流行的SIV同源性均大于等于99%(表1)。

表1 病毒基因片段同源性分析

2.2.2 HA主要氨基酸位點及抗原位點分析

2.2.2.1 裂解位點 對氨基酸序列分析發現，分離株SW/SD/5513/13 HA裂解位點氨基酸序列為PSIQSR/GL，與近年來歐洲類禽H1N1病毒HA裂解位點氨基酸組成相同，堿性氨基酸數量相對較少，為低致病力毒株。

2.2.2.2 受體結合位點 分離株SW/SD/5513/13毒株在HA蛋白受體結合位點處第155、159、226和228分別為V、N、Q和G，190位氨基酸為D，225位氨基酸為E(表2)，符合感染哺乳動物宿主的條件。

表2 豬流感病毒分離株HA受體結合位點分析

1: Isolate; 2: EA H1N1; 3: 2009/H1N1; 4: Classical swine H1N1 ; 5: Human H1N1；

2.2.2.3 糖基化位點 分離株SW/SD/5513/13與近年流行歐亞類禽H1N1 SIV的毒株具有相同數量的糖基化位點(第13、26、198、277、484、543位)。2.2.2.4 抗原位點 對H1亞型病毒HA1上5個抗原決定簇區域：Sa、Sb、Ca1、Ca2和Cb進行氨基酸位點分析，與各類型豬流感對照株比較發現，分離株SW/SD/5513/12與SW/HK/1780/2008抗原位點氨基酸組成最為相似，只在第196位氨基酸(196H)與SW/HK/1780/2008 毒株不同(196Q)(表3)。

2.2.3 致病力分析 分離株SW/SD/5513/2013 PB2蛋白未發生T271A和E627K 突變，且701位氨基酸為N，結果表明該毒株可在哺乳動物體內復制，但致病力較低。

3 討論

基因重排是流感病毒變異的重要方式之一。由于豬群對禽流感和人流感病毒均易感，因此，豬體內可能會重排產生對人類具有高致病性的新型流感病毒。目前在世界范圍內，豬流感病毒疫苗使用率極低，難于預防和控制其擴散，因此監測豬群流感發病狀況，分析豬流感病毒分子遺傳演化，確切地掌握豬流感的變化趨勢，為人類流感病毒的發生提供預警。作為豬流感病毒的重要一個類型，歐亞類禽H1N1豬流感首先分離自歐洲大陸的意大利[4]，2005年后在中國大陸逐漸大范圍流行[6]。雖然其致病力相對較低，但可感染人類，可以通過空氣飛沫傳播，因此值得關注。

本研究對山東地區2013流感季節的分離株，進行遺傳演化和分子特征分析。發現該毒株未發生基因重排，所有基因片段同源性最高的毒株均為歐洲類禽類型。HA基因進化樹分析，該毒株與SW/Jiangsu/zg8/2010(H1N1)、SW/Shaanxi/s1/2011等2008年后中國大陸分離的類禽豬流感病毒同源性較高[5-6]，表明了歐亞類禽豬流感在我國豬群感染具有持續性。與EA H1N1代表毒株A/swine/Hong Kong/1780/2008(H1N1)相比，分離株SW/SD/5513/2013 HA受體結合位點發生190D等突變，表明可有效感染哺乳動物和人類；分離株潛在的糖基化位點數量與參考株一致。除Sb抗原決定簇196位氨基酸位點不同，分離株病毒抗原性與類禽代表毒株SW/HK/1780/2008其余31個抗原位點氨基酸完全相同，但與2009H1N1、經典豬流感和人源豬流感毒株HA抗原位點存在大于10個氨基酸位點的不同。PB2關鍵氨基酸位點未發生突變，對哺乳動物致病力也相對較低，保持了歐亞類禽豬流感的低致病性特征。

表3 豬流感分離毒株HA抗原位點分析

1: Isolate; 2: EA H1N1; 3: 2009/H1N1; 4: Classical swine H1N1 ; 5: Human H1N1

對分離毒株分子特征分析表明，該毒株與2008年來流行毒株基因特性基本類似，但存在個別氨基酸的突變，導致更有效的感染人類和哺乳動物呼吸道。應進一步監測我國豬群中SIV流行株的基因變異、基因型優勢，以及病毒的致病力和傳播特性，分析目前流行毒株潛在的人際間傳播可能。

[1] Ito T, Couceiro J N, Kelm S,etal. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential[J]. J Virol, 1998, 72(9):7367-7373.

[2] Brown I H. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs[J]. Vet Microbiol, 2000, 74(1/2):29-46.

[3] Shope R E. Swine influenza: I. Experimental transmission and pathology[J]. J Exp Med, 1931, 54(3):349-359.

[4] Pensaert M, Ottis K, Vandeputte J,etal.Evidence for the natural transmission of influenza A virus from wild ducts to swine and its potential importance for man[J]. B World Health Organ, 1981, 59(1):75-78.

[5] 付新亮，方博，王麗芳，等. 一株 H1N1亞型豬流感病毒的分離鑒定及其遺傳進化分析[J].中國預防獸醫學報, 2015, 37(5): 348-352.

[6] Liu Jin-hua, Bi Yu-hai, Qin Kun,etal. Emergence of Europeanavian influenza virus-like H1N1 swine influenza A viruses in China [J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(8): 2643-2646.

[7] Qi X, Cui L, Jiao Y,etal. Antigenic and genetic characterization of a European avian-like H1N1 swine influenza virus from a boy in China in 2011[J]. Arch Virol, 2013, 158(1):39-53.

[8] Yang H,Chen Y, Qiao C,etal. Prevalence, genetics, and transmissibility in ferrets of Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses[J]. PNAS, 2016, 113(2):392-397.

[9] Hoffmann E, Stech J, Guan Y,etal. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses [J]. ArchVirol, 2001, 146(12): 2275-2289.

[10]Moreno A, Di Trani L, Faccini S,etal. Novel H1N2 swine influenza reassortant strain in pigs derived from the pandemic H1N1/2009 virus [J]. Vet Microbiol, 2011, 149(3/4): 472-477.

(編輯：李文平)

Molecular Characteristic Analysis of an Isolate of Eurasian Avian-like H1N1 Swine Influenza Virus

ZHAO Hua-yang1, WANG Jin-liang2, LIU Jin-hua2, XU Guan-long2, HOU Dong-jun3,WEN Jing-liang1, XING Jia-peng1, ZHENG Jie1，ZHANG Lian-xiang1

(1.Hua-duGroupBeijingVeterinaryBiologicsFactory,Beijing102209,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China;3.ChinaAnimalDiseasesControlCenter,Beijing100125,China)

To investigate SIV epidemic and mutant in China, we isolated one strain of SIV at one slaughter house in Shandong province in 2013, and it was identified as Eurasian avian-like H1N1 SIV (EA H1N1 SIV) by gene sequencing.Genes aligning analyzed by MEGA6.0 software shows that the isolate A/Swine/Shandong/5513/2013 (H1N1) is similar with EA H1N1 SIV epidemic in Northern China in recent years. Analysis of HA receptor sites amino acids illuminates that the isolate prefer to bind mammalian cells, not avian cells.Amino acids at the HA antigen site are same with A/swine/Hong Kong/1780/2008(H1N1), except the site 196 (Q196H).The isolate shows characteristic of low pathogenic according to the cleavage site amino acid(PSIQSR/GL)and T271 and E627 on PB2 coded protein. The information of this isolate is valuable for investigating SIV epidemiology in China.

H1N1 swine influenza virus;Eurasian avian-like; molecular characteristic

趙化陽，博士，助理研究員，從事獸用生物制品研發工作。E-mail：cxzhhy@163.com

2016-09-12

A

1002-1280 (2016) 11-0027-05

S852.65