氟甲喹的波譜學數據與結構確證

李永利，李杰，許卓妮，王東輝，陳鷹

(上海市計量測試技術研究院，上海 201203)

氟甲喹的波譜學數據與結構確證

李永利，李杰，許卓妮，王東輝，陳鷹

(上海市計量測試技術研究院，上海 201203)

建立了一種儀器分析技術確證氟甲喹化學結構的方法。采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜、一維(1H、13C、DEPT)和二維(HSQC、HMBC、1H-1H COSY)核磁共振譜、熱重分析(TGA)、差示掃描量熱法(DSC)以及X—射線粉末衍射(PXRD)對氟甲喹進行結構分析。討論了紫外和紅外吸收特征峰，詳細歸屬了所有的1H-NMR和13C-NMR信號，并對熱分析(TGA/DSC)結果進行了解析，確定了與晶型相關的不同衍射角的特征衍射峰。以上研究結果確證了氟甲喹的化學結構。

氟甲喹；波譜學；波譜特征；結構確證

氟甲喹(Flumequine)化學名為9-氟-6,7-二氫-5-甲基-1-氧代-1H,5H-苯并(ij)喹嗪-2-羧酸，屬于第二代氟喹諾酮類抗菌藥，最早由Rinker實驗室研制成功；主要作用機制在于抑制細胞復制過程中所需DNA旋轉酶，阻斷細菌DNA的復制從而發揮快速殺菌作用[1]。氟甲喹屬于廣譜抗菌劑，殺菌能力強，主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的感染，尤其是大腸桿菌、支原體、嗜水氣單胞菌引起的畜、禽及水生動物疾病[2]。由于氟甲喹具有安全性高和成本較低等特點，其在無公害養殖、畜產品和水產品等產業中應用廣泛[3]。

目前國內外有關于氟甲喹的化學合成[4]、抗菌活性[5]，和藥物代謝動力學[6]等研究的報道, 但其完整的結構解釋(UV、IR、NMR、XRPD等)尚未見報道。由于氟甲喹結構比較復雜，為了確定氟甲喹的化學結構，本文首次采用紫外吸收光譜(UV)、紅外光譜(IR)、高分辨質譜(HR-MS)、核磁共振(NMR)熱重分析( TGA)、差示掃描量熱法(DSC)、X—射線粉末衍射(PXRD) 技術，對氟甲喹進行了比較全面的結構表征。這些參數不僅可以確定氟甲喹的化學結構，還可用于確定化合物晶型，為氟甲喹的進一步鑒定和檢測分析提供了依據，也為其質量研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 PerkinElmer Spotlight 300型傅立葉紅外光譜儀，PerkinElmer公司，美國；Varian NMR System 500MHz超導核磁共振譜儀，Agilent公司，美國；Agilent 6224 Accurate-Mass TOF LC/MS液相色譜-質譜聯用儀，Agilent公司，美國；PerkinElmer Lambda 25紫外可見分光光度計，PerkinElmer公司，美國；Bruker X-射線衍射儀，Bruker公司，美國；Perkin Elmer Diamond DSC功率補償型差示掃描量熱儀，PerkinElmer公司，美國；Perkin Elmer PYRIS 1 TGA熱重分析儀，PerkinElmer公司，美國。

1.1.2 試劑 氘代二甲基亞砜，Sigma Aldrich公司，美國；色譜甲醇，Merck 公司，美國；其余試劑為分析純，試驗用水為超純水(25℃時電阻率為18.2 MΩ·cm)。氟甲喹樣品為本實驗室制備，批號為150501，經液相色譜法分析，純度大于99%，符合結構鑒定要求，分子結構見圖1。

圖1 氟甲喹的分子結構

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜 測試的氟甲喹樣品濃度為10 μg/mL甲醇溶液，以甲醇做空白，波長掃描范圍為200～400 nm[7]。

1.2.2 紅外光譜 樣品制備方法為ATR (Attenuated Total Reflection)法，測定范圍為650～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次[7]。

1.2.3 質譜 測試樣品溶液為5 μg/mL甲醇溶液，直接進樣；離子源為電噴霧正離子源(ESI+)，錐孔電壓30 V，毛細管電壓3.5 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量400 L·h-1；錐孔氣流量50 L·h-1。

1.2.4 核磁共振譜 測試溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6，含內標TMS)，1H NMR的觀測頻率為499.77 MHz，13C NMR的觀測頻率為125.68 MHz；所有二維譜均為標準序列測定[8]。

1.2.5 熱分析和X—射線粉末衍射 熱重分析方法：鉑金盤，敞開，掃描范圍為30℃～500℃，升溫速率為20℃/min，氮氣流量為40 mL·min-1。差示掃描量熱測試方法：鋁盤，不密封，掃描范圍為0 ℃～300 ℃，升溫速率為20 ℃/min，氮氣流量為60 mL·min-1[7]。X—射線粉末衍射方法：從3.000度 掃描到44.993度，步長為0.020度，陽極為Cu(40 kV, 30 mA)。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜 氟甲喹甲醇溶液的紫外光譜主要有3個吸收峰(λ1= 241 nm、λ2= 252 nm和λ3= 266 nm)，這些吸收峰是由π-π*躍遷產生的3個吸收帶[7]。這是由樣品結構中芳香環共軛結構引起的，表明該化合物存在芳香環結構片段，與氟甲喹的化學結構相符。

2.2 紅外吸收光譜 氟甲喹的紅外光譜數據見表1。表1中伸縮振動表示為ν，彎曲振動表示為δ，強吸收、中等吸收和弱吸收分別以s、m和w表示。

表1 氟甲喹樣品的紅外光譜解析表

從紅外譜圖數據表1可知，3055、1565、1466、898和885 cm-1為樣品中共軛芳香環結構的特征吸收峰[8]， 2682和1721 cm-1為羧基的特征吸收峰[9]，1620 cm-1是與苯環共軛的酮羰基吸收峰[10]，1210和1066 cm-1是叔胺結構片段的特征峰。在2991和1394 cm-1處的吸收峰，是甲基的伸縮振動和彎曲振動峰，表明樣品結構含有甲基[11]。由此說明，樣品的紅外光譜與氟甲喹應有的紅外光譜一致。

2.3 質譜 對氟甲喹溶液進行高分辨質譜(ESI-TOF-MS)分析，結果見圖2。

圖2 氟甲喹的高分辨電噴霧質譜圖

圖2中m/z262.0877是樣品的準分子離子峰[M+H]+，通過高分辨質譜HRESIMS確定其分子式為C14H12FNO3，這與氟甲喹的分子式一致。

2.4 核磁共振波譜 核磁共振技術可以提供化合物細微結構的信息，從而為結構確證研究提供更多準確可靠的信息[12]，本研究測試了樣品的一維和二維核磁數據。樣品的1H NMR見圖3，13C NMR見圖4，HSQC，HMBC及1H-1H COSY圖譜數據見表2。

圖3 氟甲喹的1H NMR圖譜

圖4 氟甲喹的13C NMR圖譜

1H NMR譜中，δH2.50為溶劑峰(DMSO峰)，δH3.34為殘留水峰。設定δH9.02的單重峰積分值為1，信號總積分為12，推斷樣品分子中氫原子數為12或12的整數倍。在圖譜高場區，質子信號δH1.40 (d, 7.0)的積分值為3，耦合裂分為二重峰, 表明分子結構中存在與次甲基相連的甲基；位于δH2.14、3.08、3.16的信號，根據其化學位移以及積分值信息，推測其應為分子中的兩個亞甲基的吸收峰；化學位移δH4.94的吸收峰信號，則歸屬為與氮原子相連的次甲基。低場有四組質子信號：δH7.74、7.81、9.02、15.11 ，其中前三組均為芳香環上的氫信號，δH15.11加D2O交換后消失，表明其為羧基上的氫。

13C NMR圖譜顯示14組碳信號，分別對應結構中的14個碳原子，結合DEPT-135譜可確定結構含有1個甲基、2個亞甲基、4個次甲基和7個季碳信號，其中δ165.9為羧基碳信號，δ176.9為酮羰基碳信號。在高場部分，δ20.0吸收峰對應于甲基C-13；δ21.5，25.1處的吸收峰分別對應于亞甲基C-10和C-11；12位次甲基碳與電負性較強的N原子相連，信號向低場移動，化學位移應為δ57.4。在低場部分，δ107.9，121.7和147.4分別對應于芳香環上的三個次甲基C-5、C-7和C-2，C-2因與N原子相連，化學位移偏向低場；δ159.1處吸收峰產生分裂，耦合常數J= 246 Hz，表明其為直接與F原子相連接的C-6，而C-5和C-7的吸收峰耦合常數也符合鄰位碳的裂分規律。

在HSQC譜中，可以看到13位甲基、10和11位兩個亞甲基、12位次甲基以及芳香環的三個氫H-2、H-5、H-7的碳氫相關信號(表2)。在HMBC譜中，H-2與酮羰基C-4、羧基C-9、次甲基C-12以及季碳C-3、C-8A相關；H-5與酮羰基C-4，芳香環碳C-6、C-7、C-8A相關；H-7與C-5、C-6、C-8A、C-10相關；亞甲基上氫H2-11與芳香環C-8、脂肪鏈上亞甲基C-10、次甲基C-12、甲基C-13存在相關信號。在1H-1H COSY譜中，可以提供1H-1H之間成鍵作用的相關信息，可以看到H2-10/H2-11/H-12/H3-13相關信號，表明脂肪鏈上的11位亞甲基與10位亞甲基、12位次甲基直接相鄰，12位次甲基與11位亞甲基、13位甲基直接相鄰。以上結果與氫譜、碳譜、DEPT和 HSQC譜的數據完全符合。1H-NMR、13C-NMR譜、HSQC、HMBC和1H-1H COSY 數據及歸屬見表2。

表2 氟甲喹樣品的核磁共振數據表

2.5 熱重分析(TGA) 、差示掃描量熱分析(DSC)和X-射線粉末衍射 TGA 測得樣品在溫度約為 248.77 ℃ 時開始失重，在此之前隨溫度升高未發生失重現象，表明氟甲喹不含結晶水[13]，且所測樣品基本不含有吸附水與殘留溶劑。

DSC圖譜顯示樣品在252.62 ℃～255.39 ℃有1個熔化吸熱峰，在254.74 ℃時為最大吸熱點，且為單一特征吸熱峰。由此表明，氟甲喹樣品為單一晶型的結晶性粉末，隨溫度升高晶型穩定，不存在轉晶現象。

X-射線粉末衍射測定數據見表3。在X-射線粉末衍射圖譜中樣品具有尖銳的衍射極大，說明氟甲喹樣品為一晶體物質。

表3 樣品 X-射線粉末衍射測試數據

3 討論與小結

結構確證要求原料的純度達到98%以上。因此，結構確證應首先測定原料的純度。通過液相色譜法的測試，表明氟甲喹原料符合結構確證的純度要求。

高分辨率質譜能精確到小數點后面4位，能給出精確分子量，從而給出分子式。本實驗通過樣品的高分辨質譜測試，得到分子式C14H12FNO3，這和氟甲喹的分子式一致。樣品在紫外241、252和266 nm處有最大吸收，這與氟甲喹結構中存在的芳香環片段相符合。紅外光譜顯示，樣品在1565和1466 cm-1存在強吸收，也對應于前面的芳香環結構，1721 和1620 cm-1處的強吸收分別對應于結構中羧基的特征吸收峰以及與苯環共軛的酮羰基吸收峰。這些特征均與氟甲喹的化學結構一致。

核磁共振碳譜測試需要樣品的濃度較高(一般20～50 mg樣品溶于0.5 mL氘代溶劑)，而喹諾酮類化合物在常規氘代溶劑(D2O、CD3OD、CDCl3、CD3COCD3)中溶解度較小，造成在這些溶劑中的碳譜信號很少導致無法解析。經過測試發現在氘代二甲基亞砜中溶解度雖然稍好但還是偏低，故在測試前先加熱促進溶解，再進行核磁測試，最終得到高質量的核磁信號。在此基礎上，首次對氟甲喹的1H 和13C NMR信號進行了詳細的解釋，確定目標化合物的一維核磁數據與氟甲喹的分子結構式一致，二維譜的解析進一步確證了氟甲喹的化學結構。

本文首次報道了X-射線粉末衍射特征衍射峰特征，在反射角2θ為10.006、10.300、11.150、16.833、20.050、22.457、25.339、26.402、27.747、34.337處有特征峰，進一步為該藥物生產中的質量控制提供了重要的參考依據。

綜上所述，本工作通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、質譜等波譜學的研究可以確定目標化合物就是氟甲喹。X射線粉末衍射分析確定該樣品呈結晶狀態，給出了衍射角度、晶面距、相對豐度等晶體結構參數。該方法可以作為氟甲喹的結構確證方法，也為此類化合物的定性以及結構解析提供了客觀的分析依據。

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(編輯：陳希)

Spectral Analysis and Structural Confirmation of Flumequine

LI Yong-li，LI Jie，XU Zhuo-ni， WANG Dong-Hui，CHEN Ying

(ShanghaiInstituteofMeasurementandTestingTechnology,Shanghai201203,China)

A method for determination of chemical structure of flumequine was established. The structure was elucidated by UV, IR, MS, 1D NMR (1H,13C, DEPT) and 2D NMR (HSQC, HMBC,1H-1H COSY), DSC, TGA, and PXRD. The UV and IR absorption peaks were discussed, and all the signals of1H-NMR and13C NMR were attributed to their respective structures and positions in the molecule. The test result of TGA /DSC was analyzed，and the diffraction peaks of the different diffraction angles related to the crystal form were determined．The experiment verified that the chemical structure of this compound is flumequine.

flumequine; spectroscopy; spectroscopic characteristic; structure confirmation

上海市技術性貿易措施應對專項項目(14TBT007；15TBT009)

李永利，博士，工程師，從事天然藥物及有機分析相關研究。E-mail: jinchi333@126.com

2016-03-16

A

1002-1280 (2016) 05-0029-05

R917