氯丙那林在牛血和牛尿兩種易獲表征樣本中的消除規(guī)律研究

朱聰英，周煒，陸春波，陳慧華,應(yīng)永飛，張航俊，侯軒，周志強

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，杭州 311199)

氯丙那林在牛血和牛尿兩種易獲表征樣本中的消除規(guī)律研究

朱聰英，周煒*，陸春波，陳慧華,應(yīng)永飛，張航俊，侯軒，周志強

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，杭州 311199)

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對肉牛血清和尿液兩種易獲表征樣本中氯丙那林消除規(guī)律進行了研究。選取4只雌性健康育肥期肉牛(500±25)kg，其中1只作為對照，3只作為試驗組，每日將氯丙那林按1 mg/kg·bw 經(jīng)基礎(chǔ)日糧拌飼試驗組肉牛一次，連續(xù)飼喂30 d后停止給藥，繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)日糧45 d。牛血清樣品中于首飼后第2小時，即出現(xiàn)100 ng/mL左右氯丙那林，隨后血藥濃度逐步上升，并于持續(xù)給藥20 d達到峰值。在停止給藥后第3天，牛血清樣品中氯丙那林殘留量已低于方法檢測限。牛尿樣本中于首飼當天，即檢出358～1456 ng/mL氯丙那林，連續(xù)給藥期牛尿中氯丙那林殘留量個體差異較大，在停止給藥后21 d時，牛尿中仍有低濃度氯丙那林檢出，在休藥后45 d，牛尿中未檢出氯丙那林。血清及尿液樣本可較為準確地反映養(yǎng)殖過程氯丙那林非法使用情況，尿液樣本的監(jiān)測對活體肉牛無害化處理過程具有指導(dǎo)意義。

氯丙那林；牛血；牛尿；表征樣本；消除

氯丙那林(Clorprenaline，CLO)，是一種選擇性β2-受體激動劑，有明顯的支氣管擴張作用，因而被應(yīng)用于臨床治療支氣管炎、喘息性支氣管炎等。盡管氯丙那林對β2-受體的選擇性和作用強度弱于沙丁胺醇，但是適當劑量的氯丙那林能促進動物生長并提高瘦肉率[1]，因而，近年來，作為一種新的“瘦肉精”替代品，被發(fā)現(xiàn)非法添加于飼料、動物飲水[2]以及獸藥制劑中[3]。氯丙那林也可用作運動員的“興奮劑”，但醫(yī)學實驗已證明其殘留會嚴重影響人類健康，人如果長期食用含有β-受體激動劑殘留的豬肉，會增加致癌和致畸風險。與此同時，由于同為β-受體激動劑的克倫特羅會引起人體急性中毒，甚至死亡，因而中國、歐盟和國際奧委會(the International Olympic Committee，IOC)等國家和國際組織明令禁止現(xiàn)役運動員賽前使用β-受體激動劑[1]，也不得將其用于食品動物[4]。現(xiàn)采用農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008[5]、農(nóng)業(yè)部1063號公告-3-2008[6]和農(nóng)業(yè)部1063號公告-6-2008[7]，分別對動物源性食品中、動物尿液中和動物飼料中的氯丙那林濃度進行測定。

然而，迄今為止，國內(nèi)外尚無關(guān)于氯丙那林在動物體內(nèi)吸收與排泄速度的報道，在監(jiān)測靶組織的選取、無害化處理活體家畜方案的制訂等方面均無可靠數(shù)據(jù)支撐。本研究旨在通過肉牛飼喂試驗，并監(jiān)測牛血清和牛尿兩種動物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)易獲表征樣本中氯丙那林的濃度，以摸索氯丙那林在牛體內(nèi)的消除規(guī)律，以期為農(nóng)業(yè)、公安等行政執(zhí)法部門提供科學依據(jù)與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

1.1.1 實驗動物與試驗方案 為便于尿樣采集，選取4只體重約500±25 kg雌性健康育肥期肉牛，分圈飼養(yǎng)，其中1只作為對照(標記為0號牛)，另3只作為試驗組(標記為1～3號牛)，預(yù)飼一周。試驗肉牛每日8:00飼喂精料(杭州市正平生物科技有限公司提供)各1.75 kg/只，精料組成：玉米、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、麥麩、魚粉、飼料級磷酸氫鈣、石粉、食鹽及各類維生素、微量元素。營養(yǎng)成份(%)：粗蛋白≥18.0，粗纖維≤9.5，粗灰分≤10.0，鈣0.7～1.8，總磷≥0.40。肉牛自由采食青貯牧草(營養(yǎng)成分(%)：粗蛋白≥17.25，粗脂肪≥3.35，粗纖維≤12.8，鈣1.34，磷0.66，賴氨酸0.89，含硫氨基酸0.67)，保證充足飲水。

試驗開始后，于每日8:00補飼時，將氯丙那林按1 mg/kg·bw 經(jīng)基礎(chǔ)日糧拌飼試驗組肉牛一次，連續(xù)飼喂30 d，第31天停止給藥，繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)日糧45 d(備注：飼喂第30天，宰殺3號牛，以作它用)。

1.1.2 樣品的采集與處理 血液樣品分單劑量給藥24 h、連續(xù)單劑量給藥期、休藥期三階段，采集牛尾靜脈血液，血液經(jīng)離心分離制備血清，-20 ℃冷凍保存。單劑量給藥24 h樣品共收集首次給藥開始前(記為0 h)和首次給藥后2、4、6、8、10、12、24 h(即第2 天樣品)共八個時間點。連續(xù)單劑量給藥樣品分別于飼喂第3、5、7、10、15、20和25 天飼喂開始前血液。休藥期樣品分別于休藥后第3、7、14、21、45 天飼喂基礎(chǔ)日糧開始前血液。

考慮到牛尿次數(shù)與總量大小等因素，尿液樣本分給藥期、休藥期二階段采樣，采集到的尿液樣品，記錄采集時間點，并立即-20 ℃冷凍保存。給藥期分別采集給藥第1、2、3、5、10、15、20和25天的一份牛尿樣。休藥期分別采集休藥后第3、7、14、21和45天的一份牛尿樣品。

1.2 儀器與材料 Agilent 1290N 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AB 5500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國AB公司)，配電噴霧離子源(ESI)；電子天平(瑞士Mettler，精度十萬分之一)；SLS固相萃取小柱(400 mg/6 mL，杭州福裕科技服務(wù)有限公司)；離心機(德國Sigma公司)；氮吹儀(美國Organomation Associates, JNC)。氯丙那林、D9-克倫特羅標準品，均購自Wigega Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH公司。

氯丙那林標準工作液：精密稱取氯丙那林適量對照品，用甲醇制備成為100 ng/mL的標準工作液，-20 ℃保存。內(nèi)標工作液：精密稱取D9-克倫特羅標準品適量，用甲醇分別制備成為100 ng/mL的內(nèi)標工作液，-20 ℃保存。

試驗用甲醇、鹽酸、乙酸乙酯、氨水均為分析純，甲酸及作為流動相的甲醇均為色譜純，水為超純水。

1.3 樣品預(yù)處理方法

1.3.1 血清樣品 準確移取血清樣品[5,8]1.00 mL于50 mL離心管中，加入內(nèi)標工作液100 μL后，再加入5.0 mL乙酸銨緩沖液(0.2 moL/L，pH=5.2)和鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(β-Glucuronidase/aryl sulfatase)40 μL，渦旋混勻，于37 ℃避光酶解16 h。酶解后，加入高氯酸適量使其pH值在2.0左右，渦旋混勻，12000 r/min離心10 min。將全部上清液倒入依次經(jīng)3 mL甲醇和3 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液活化好的SLS固相萃取小柱中，待供試液流盡后，以3 mL水和3 mL甲醇依次淋洗小柱。用9 mL 5%氨化乙酸乙酯(臨用新制，并超聲使其成乳濁液)洗脫，收集全部洗脫液于10 mL具塞玻璃管中，60 ℃水浴條件下，用氮氣吹干。加入1.0 mL 0.2% 甲酸水溶液后，超聲1 min，充分渦旋混勻后，過0.22 μm 水系濾膜。濾液供HPLC-MS/MS檢測。

1.3.2 尿液樣品 準確移取尿樣[8]5.00 mL于50 mL離心管中，加入內(nèi)標工作液100 μL后，經(jīng)高氯酸調(diào)pH至2.0左右。后續(xù)操作同血清樣品處理。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis dC18柱(3.0 mm×150 mm，粒徑3 μm)；流動相見表1；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；流速300 μL/min。

表1 流動相組成

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；離子源電壓：5500 V；輔助加熱氣溫度：500 ℃；氣簾氣流速(Curtain Gas)：40 L/h；脫溶劑流速：中等(Medium)；離子源氣流速：霧化氣(Gas 1)為45 L/h，輔助氣(Gas 2)為25 L/h；駐留時間(dwell time)：20 ms；多反應(yīng)監(jiān)測離子的定性、定量離子對及錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測離子對及質(zhì)譜條件

注：*：定量離子

2 結(jié)果與分析

2.1 氯丙那林在牛血中的代謝規(guī)律

圖1 單劑量給藥24 h牛血清中氯丙那林的含量變化曲線

2.1.1 單劑量給藥時的代謝規(guī)律 從圖1中可以看出，3頭試驗用牛均在飼喂氯丙那林后2 h血液中即出現(xiàn)了氯丙那林(1號牛：129.0 ng/mL；2號牛：77.17 ng/mL；3號牛：70.58 ng/mL)，并逐步升高，且均在給藥后第6小時濃度達到峰值，隨后略呈下降趨勢。在飼喂后第10小時時，血清中氯丙那林濃度又略現(xiàn)升高趨勢，結(jié)合3頭牛在首次給藥后的12 h和24 h時血清中氯丙那林濃度比：1號牛升高2.3倍，2號牛升高11.5倍，3號牛升高0.6倍，推測這可能與夜間牛群反芻有關(guān)。

2.1.2 連續(xù)單劑量給藥期的代謝規(guī)律 從圖2中不難看出，3頭試驗用牛血清中氯丙那林濃度隨給藥時間的延長而不斷升高，隨后略呈下降趨勢。由于缺少后續(xù)數(shù)據(jù)支撐，20 d時牛血清中氯丙那林濃度是否即為飽和濃度，仍需后續(xù)深入研究。

圖2 連續(xù)單劑量給藥牛血清中氯丙那林的含量變化曲線

2.1.3 休藥期的消除規(guī)律 在停止給藥后第3天開始所收集到的牛血中氯丙那林濃度已低于檢測限(0.1 ng/mL)，表明氯丙那林在牛血中的代謝速率很快，或全部轉(zhuǎn)入組織中，或全部經(jīng)尿/糞排泄，或全部轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物。

2.2 氯丙那林在牛尿中的消除規(guī)律 給藥期內(nèi)，如圖3所示，在飼喂氯丙那林當日，牛尿中即出現(xiàn)高濃度氯丙那林，其中1號牛達到1460 ng/mL(收集于給藥后3 h)，2號牛達到865.2 ng/mL(收集于給藥后2 h)，3牛則為358.4 ng/mL(收集于給藥后3 h)。王麗娜等對克倫特羅在絨山羊尿液中的代謝規(guī)律研究顯示[9]，羊群在給藥劑量分別為150 μg/kg·bw和300 μg/kg·bw時，單劑量給藥24 h內(nèi)羊尿中克倫特羅濃度分別達到289 ng/mL和1323 ng/mL。其研究結(jié)果與本試驗結(jié)果相仿。受飲水量/排尿量比值、排尿時間等諸多因素影響，在連續(xù)給藥期間，牛尿中氯丙那林濃度個體差異很大且未呈現(xiàn)出特定變化規(guī)律，這一結(jié)果亦與王麗娜等的研究結(jié)果相近[9]。

圖3 連續(xù)給藥期牛尿中氯丙那林的含量變化曲線

如圖4所示，2頭牛在休藥期表現(xiàn)出相近的濃度變化曲線，牛尿中氯丙那林在休藥第3天明顯大幅下降，至在停止給藥后的第21天時，1號(0.8 ng/mL)和2號牛尿(0.4 ng/mL)中仍含低濃度氯丙那林，在停止給藥后的第45天時，牛尿中未檢出氯丙那林。王麗娜等的研究結(jié)果顯示[9]，在停止給藥40 d后，羊尿中仍有6～9 mg/mL克倫特羅檢出，表明這兩種β-受體激動劑在反芻動物體內(nèi)均有較長的分解代謝過程。

圖4 停止給藥后牛尿中氯丙那林的含量變化曲線

3 討論與小結(jié)

3.1 從牛尾靜脈采血而獲得血清樣品，可作為肉牛養(yǎng)殖、運輸環(huán)節(jié)和屠宰前監(jiān)測肉牛是否受氯丙那林污染 氯丙那林(1 mg/kg·bw 經(jīng)基礎(chǔ)日糧拌飼)給藥后2 h，牛血清樣品中即出現(xiàn)100 ng/mL左右氯丙那林，隨后血藥濃度逐步上升。在持續(xù)給藥20 d左右，出現(xiàn)峰值。在停止給藥后第3天，牛血清樣品中氯丙那林殘留量已低于方法檢測限。整體而言，血清樣品中氯丙那林殘留量不受其他因素影響，較為準確地反映養(yǎng)殖過程用藥情況。

0號牛，即對照組肉牛血清中氯丙那林濃度全程低于檢出限。關(guān)于活體動物血清中β-受體激動劑的代謝研究鮮有報道，氯丙那林及其代謝物在牛血清中的代謝研究有待進一步深入。經(jīng)過先前的方法學考察，本研究中所建立的牛血清中氯丙那林殘留檢測方法，簡便易行、重現(xiàn)性和準確性能滿足日常檢測要求。同時，綜合單劑量給藥24 h、連續(xù)單劑量給藥期、休藥期三階段研究結(jié)果，從牛尾靜脈采血而獲得血清樣品，可作為肉牛養(yǎng)殖、運輸環(huán)節(jié)和屠宰前監(jiān)測肉牛是否受氯丙那林污染的易獲表征樣本。

3.2 牛尿可作為飼養(yǎng)、運輸環(huán)節(jié)氯丙那林使用情況監(jiān)測用樣品，以及肉牛活體無化害處理過程監(jiān)測的有效的易獲表征樣本 氯丙那林(1 mg/kg·bw 經(jīng)基礎(chǔ)日糧拌飼)給藥當天，牛尿中即檢出358～1456 ng/mL氯丙那林，受飲水量/排尿量比值、排尿時間等因素影響，連續(xù)給藥期牛尿中氯丙那林殘留量個體差異較大。在停止給藥后21 d時，牛尿中仍有低濃度氯丙那林檢出，在休藥后45 d，牛尿中未檢出氯丙那林。整體而言，尿液中氯丙那林殘留易受總尿量影響，濃度波動幅度大，但對活體肉牛無害化處理過程具有指導(dǎo)意義。

0號牛，即對照組肉牛尿樣中氯丙那林濃度全程低于檢出限。盡管牛尿中氯丙那林濃度受排尿量等因素影響，但3頭試驗用牛在飼喂期間濃度波動范圍在108.8～1460 ng/mL之間，能真實反映用藥與否。同時，休藥后21 d，仍有低濃度氯丙那林檢出，表明牛尿可作為飼養(yǎng)、運輸環(huán)節(jié)氯丙那林使用情況監(jiān)測用樣品。同時，由于該方法簡便易行，對活體肉牛無害化處理過程具有指導(dǎo)意義。

值得注意的是：畢言鋒等對氯丙那林在豬尿中的主要代謝產(chǎn)物研究顯示[2]，羥基化氯丙那林及其軛合物是豬尿中的主要代謝產(chǎn)物，其濃度約為氯丙那林原型及其軛合物的2倍左右。因而，反芻動物尿液中氯丙那林殘留標示物的研究，還有待進一步深入研究。

[1] Hongyuan Yan, Suting Liu, Mengmeng Gao,etal. Ionic liquids modified dummy molecularly imprinted microspheres as solid phase extraction materials for the determination of clenbuterol and clorprenaline in urine[J]. Journal of Chromatography A, 2013,(1294)： 10-16.

[2] 畢言鋒, 王亦琳, 葉妮, 等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜檢測和鑒定豬尿中氯丙那林的主要代謝產(chǎn)物[J]. 色譜, 2015, 33(7):704-710.

[3] 周煒, 陳慧華, 應(yīng)永飛, 等. 高效液相色譜-四級桿/線性離子阱質(zhì)譜法篩查獸藥中非法添加物的研究[J]. 中國獸藥雜志, 2014, 48(4):24-28.

[4] 農(nóng)業(yè)部1519號公告.禁止在飼料和動物飲水中使用苯乙醇胺A等11種物質(zhì)[S].

[5] 農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008. 動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[6] 農(nóng)業(yè)部1063號公告-3-2008. 動物尿液中11種β-受體激動劑的檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[7] 農(nóng)業(yè)部1063號公告-6-2008. 飼料中13種β-受體激動劑的檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[8] 周煒, 朱聰英, 應(yīng)永飛, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物尿液中23種β-受體激動劑的檢測[J]. 中國獸藥雜志, 2013,47(9):46-52.

[9] 王麗娜, 劉凱, 李延山, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究克倫特羅在絨山羊體內(nèi)消除規(guī)律[J]. 中國獸藥雜志, 2014,48(3):42-46.

(編輯：侯向輝)

Metabolism of Clorprenaline in Serum and Urine of Beef Cattles

ZHU Cong-ying, ZHOU Wei*, LU Chun-bo, CHEN Hui-hua， YING Yong-fei, ZHANG Hang-jun, HOU Xuan, ZHOU Zhi-qiang

(AnimalProductsQualityTestingCenterofZhejiangProvince,Hangzhou311199,China)

The metablism of Clorprenaline (CLO) in serum and urine, which are two kinds of characteristic samples could be easy acquired were investigated in 4 female fattening beef cattle by LC-MS/MS.Three cattles were supplied with CLO, mixed with concentrated feed, once perday at 1 mg/kg·bw level and last 30 days，then a 45 days off-drug period was followed. In serum, 100 ng/mL CLO were detected at 2 h after the single dose of exposure, then the blood concetration were increased progressively untill 20 days. But just after 3-day drug withdrawal, the levels of CLO were under detecion limit. In urine, the concentrations of CLO were between 358 ng/mL and 1456 ng/mL after the single dose of exposure. Due to various reasons, sharp fluctuation of the CLO level in urine were observed during the continuous exposure. Till 3-week drug withdrawal, low level of CLO could aslo be found, which were under detecion limit at 45th day. The serum and urine could be used to monitor the illegal using of CLO, and the monitoring of CLO in urine have directive significance to the innocent treatment of live beef cattles.

clorprenaline; cattle serum; cattle urine; characteristic samples; metabolism

公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專項(201203023-4)

朱聰英，高級畜牧師，從事畜產(chǎn)品及投入品質(zhì)量安全檢測與質(zhì)量管理研究。

周煒。E-mail: zhouwei0732@sohu.com

2016-02-27

A

1002-1280 (2016) 05-0034-05

S859.79