鯉I-IFN-γ作為錦鯉皰疹病毒核酸疫苗免疫佐劑的效果研究

于慧，張瑞雪，王好，周井祥*，劉艷輝

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118;2.吉林省水產科學研究院，長春130033)

鯉I-IFN-γ作為錦鯉皰疹病毒核酸疫苗免疫佐劑的效果研究

于慧1，張瑞雪1，王好1，周井祥1*，劉艷輝2*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118;2.吉林省水產科學研究院，長春130033)

為了研究鯉Ⅰ-IFN-γ的免疫效果，根據鯉Ⅰ-IFN-γ的mRNA基因序列(GenBank)，構建真核表達質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ，重組表達質粒與不同劑量的轉染試劑EndoFectionTM Max混合后轉染鯉魚肌肉細胞，通過熒光倒置顯微鏡觀察，重組表達質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ在細胞中成功表達。以多種免疫劑量的重組表達質粒與pIRES-ORF81混合對鯉魚進行肌肉注射，每周免疫一次，共免疫三次，免疫前采血，收集血清，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗體水平。結果表明：于第三次免疫后兩周，抗體水平達到最高，聯合免疫與單獨免疫核酸疫苗pIRES-ORF81相比，抗體水平明顯升高，但差異不顯著(P>0.05)。鯉Ⅰ-IFN-γ作為錦鯉皰疹病毒的免疫佐劑具有一定的免疫效果。

鯉I型γ干擾素；錦鯉皰疹病毒；核酸疫苗pIRES-ORF81；免疫效果

錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)能夠引發鯉魚發生高致病性的錦鯉皰疹病毒病(Koi Herpesvirus Disease，KHVD)，病毒傳播迅速，致死率極高。世界動物衛生組織(OIE)已經將KHVD列為必需報告的疾病[1]。目前仍然沒有治療該病的特效藥物，只能通過相關免疫手段對其進行預防，接種疫苗被認為是水產病毒性疾病預防和治療的最適當方法，單一疫苗對魚的免疫效果并不能達到預期目標。因此，利用佐劑或免疫刺激劑來增加疫苗功效是一種新的途徑。

干擾素(Interferon, IFN)是一種重要的細胞因子，可作為生化制劑類免疫佐劑，具有抗病毒功效，能在病毒感染后迅速起效[2]。細胞和機體通常需要病毒、核酸、細菌內毒素等刺激才能產生干擾素。Ⅰ型干擾素γ(Ⅰ-IFN-γ)是發展先天免疫反應的重要組份[3]。它可激活IFN刺激因子(ISGs)轉錄，編碼不同的抗病毒蛋白，釋放抗病毒物質，干擾病毒復制、增殖，調節機體細胞分化[4]、生長[5]。

盡管在魚類的干擾素活性很久以前就被人所知，但直到2003年三種魚的Ⅰ-IFN-γ才被克隆，分別為斑馬魚[6](Daniorerio)，大西洋鮭(Salmosalar)[7]和河豚魚。目前已經在部分硬骨魚中克隆到了Ⅰ型IFN基因，其中包括，鯰(Ictaluruspunctatus)[8]，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[9]，黑鱸(Micropterussalmoides)[10]，三棘魚(Gasterosteusaculeatus)[11]，牙鲆(Paralichtsolivaceus)[12]，舌齒鱸(Diceutrarchuslabrax)[13]，鯉(Capriuscarpio)[14]，石斑魚(Epiuephelusseptemfas-ciatus)[15]，大黃魚(Larimichthyscrocea)[16]等，并發現其中鯉、石斑魚、舌齒鱸的Ⅰ型IFN-γ基因在魚體抗病毒過程中起到重要作用。魚的Ⅰ-IFN-γ有獨特的基因組，5個外顯子，4個內含子結構，這點是有別于其它物種的關鍵[17]。

在病毒感染魚的初期，Ⅰ-IFN-γ是發展先天免疫反應重要組份[3]。通過病毒感染細胞產生和釋放Ⅰ-IFN-γ導致IFN刺激因子的(ISGs)激活和轉錄，編碼不同的抗病毒蛋白，通過抗病毒物質干擾病毒復制，抗增殖和免疫調節活動[18]。關于Ⅰ-IFN-γ反應在魚類異皰疹病毒科中了解比較少[19]。在體外研究中，CyHV-3有能力抑制源于鯉魚腦細胞(CCB)的成纖維細胞中Ⅰ-IFN-γ反應，在頭腎白細胞(HKL)中并無此現象。但如果先用多聚肌苷酸胞苷酸(poly I: C)刺激CCB細胞，激活Ⅰ-IFN-γ反應，通過細胞單層培養，發現這樣能夠減緩CyHV-3傳播速度。體外研究發現，CyHV-3感染時，皮膚和腸中IFN編碼的基因表達上調[20-21]。

本研究選擇構建pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ真核表達質粒，研究pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ與PIRES-ORF81核酸疫苗組成的聯合制劑的免疫原性，為KHVD疫苗的研制提供新的思路。

1 材料

1.1 動物 150條健康鯉魚，體重為150～200 g，購自新立湖的漁場，在25℃水族箱飼養2周后再進行試驗。

1.2 質粒和病毒 重組質粒PIRES-ORF81由本試驗室保存[22]，KHV陽性血清由本試驗室保存[23]。

1.2 主要試劑 焦磷酸二乙酯(DEPC),北京鼎國公司;反轉錄試劑,TaKaRa;DL5000 Marker,DL2000 Marker，pMD18-T Vector，限制性內切酶，T4DNA連接酶,TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒,AxyGen公司;質粒轉染試劑EndoFectinTM-Max,長春維爾特科技有限公司;羊抗鼠IgG-HRP,上海信然生物技術有限公司;抗鯉魚IgM單克隆抗體,AQUATIC Diagnostic Ltd。

2 方法

2.1 鯉Ⅰ-IFN-γ基因的引物設計與合成 根據GenBank上登錄的鯉Ⅰ-IFN-γ基因序列，用Primer Premiers 5.0軟件設計引物，上游引物P3序列：5’-GAGCTCAATTTGAGAAAAAAATCGTAACAAA-3’ ；下游引物P4序列：5’-AAGCTTAATTTGAGAAAAAAATCGTAACAAA-3’ ；劃線部分依次為限制性酶切位點SacⅠ和HindⅢ，送去生工(上海)公司合成引物。

2.2 Ⅰ-IFN-γ基因的擴增 試驗所用器材需提前用DEPC水處理，取新鮮鯉魚頭腎樣品及脾臟樣品充研磨成粉末狀待用，用TRIzol法提取RNA并進行反轉錄。產物用于PCR擴增，基因擴增體系為25 uL，用梯度PCR儀摸索最適退火溫度，確定PCR反應條件為：95 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，61.5 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環，72 ℃ 10 min，反應結束 4 ℃ 保存。

2.3 Ⅰ-IFN-γ基因的克隆及鑒定 將回收的Ⅰ-IFN-γ目的基因連接至pMD-18T克隆載體，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α菌種，向含Amp的固體LB平板中涂100 μL上述菌液，恒溫(37 ℃)過夜培養，挑取的白色單個菌落接種于液體培養基中，堿裂解法提取質粒，用SacⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，陽性質粒送到生工(上海)進行基因測序，命名為pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ。2.4 構建重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ 將目的基因Ⅰ-IFN-γ與pEGFP-N1載體16 ℃過夜連接。轉入DH5α感受態細胞內，向含Kana液體LB培養基內加入挑取的單菌落，160 r/min震蕩培養(37 ℃，12～14 h)，堿裂解法提取質粒經PCR鑒定、雙酶切鑒定，選取陽性質粒命名為pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ并送至生工(上海)進行測序。

2.5 重組質粒的體外表達

2.5.1 重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ的大量提取與純化 將pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ質粒的菌液進行劃線培養，挑單一白色菌落至液體培養基中振蕩培養至對數生長期，之后進行菌液的擴搖，收集菌體進行質粒大量提取，采用質粒大提試劑盒，方法參照AxyGen質粒大量說明書。使用分光光度計測定重組表達質粒在260 nm波長時的吸光值，根據重組表達質粒的濃度計算公式：質粒濃度(μg/μL)=OD260×稀釋倍數×50 μg/mL。2.5.2 重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ的轉染 將重組表達質粒、EndoFectionTM Max試劑和L-15培養基靜置使之升至室溫。用L-15培養基分別稀釋重組表達質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ和轉染試劑EndoFectionTM Max，稀釋后室溫靜置5min。將稀釋后的重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ于不同濃度的轉染試劑EndoFectionTM Max充分混勻，室溫靜置5～20 min形成DNA-EndoFectionTM復合物。向每個細胞培養孔中逐滴加入DNA-EndoFectionTM復合物，邊滴加邊輕柔前后晃動培養板。操作時，應避免把轉染試劑直接滴在細胞生長的位置.在26 ℃培養箱中孵育細胞，轉染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染情況并采集圖片。分別提取細胞(轉染后)總RNA，方法與提組織RNA相似，再進行RT-PCR及PCR。

2.6 重組質粒與核酸疫苗聯合免疫體內試驗 免疫試驗前，隨機挑選11尾試驗魚進行KHVD的檢測，PCR檢測呈陰性后，將魚分6組，每組10尾(表1)。注射劑量均稀釋為200 μL/尾，三次免疫間隔14 d。

表1 鯉魚免疫分組及免疫劑量

2.7 重組表達質粒誘導鯉的免疫效果檢測 尾靜脈采血于免疫前，在一免及二免后第一周，三免后一到三周。標記的滅菌EP管中貯存采取的血液，靜置(37 ℃，2 h)，4 ℃過夜，隔天離心6000 r/min(4 ℃，15 min)，收集血清后貯存于-20 ℃，用于ELISA檢測。在96孔酶標板中，用包被液將純化后的病毒液稀釋，每孔100 μL，4 ℃放置一夜洗滌后加入封閉液(新鮮配制的脫脂牛奶)，置于22 ℃，孵育2 h后，再次洗滌，然后加入待測血清22 ℃孵育3 h；洗滌5次后加入單克隆抗體22 ℃孵育1 h；洗滌5次后加入酶標二抗22 ℃孵育1 h；再次洗滌5次，加入100 μL底物溶液，22 ℃孵育10 min；再加入50 μL終止液；最后將酶標板放入酶標儀中，測定在OD 450 nm時的ELISA數據，記錄結果。

3 結果

3.1 Ⅰ-IFN-γ的PCR擴增 分別以提取的鯉魚頭腎RNA及脾臟RNA為模板，反轉錄為cDNA后，再分別以Ⅰ-IFN-γ的P1，P2序列為引物，通過PCR擴增得到552 bp的預期大小的目的片段，如圖1所示。

M： DNA分子量標準；1-3：PCR產物(Ⅰ-IFN-γ);4：陰性對照圖1 Ⅰ-IFN-γPCR擴增產物

3.2 Ⅰ-IFN-γ基因克隆質粒的鑒定 用限制性內切酶SacⅠ和HindⅢ對pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ陽性質粒進行雙酶切鑒定。結果顯示在552bp位置有條帶，同時有一條2000bp以上條帶。與預期相符，說明pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ質粒構建成功，如圖2所示。

M：DNA分子質量標準；1：雙酶切產物(pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ)圖2 雙酶切鑒定pMD18-T-Ⅰ-IFN-γ

3.3 重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ鑒定 分別用限制性內切酶SacⅠ和HindⅢ對陽性重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ進行雙酶切鑒定。結果顯示的目的片段大小與預期結果相符，在552 bp位置有條帶，同時各有一條片段大小為4645 bp的載體條帶。進一步說明已經成功將Ⅰ-IFN-γ基因克隆到pEGFP-N1真核表達載體上，如圖3所示。

M：DNA分子質量標準；1： pEGFP- N1-Ⅰ-IFN-γ酶切結果圖3 酶切鑒定重組質粒pEGFP-IFN-N1-Ⅰ

3.4 重組表達質粒濃度 根據2.9.2中的計算方法計算pEGFP-N1-IL-10，pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ和PIRES-ORF81的濃度分別為0.85、0.9、0.8μg/μL。

3.5 重組表達質粒的轉染 根據2.1中所述步驟，將重組質粒pEGFP-N1-IL-10和pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ轉染至錦鯉鰭條細胞中，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到有質粒成功轉入細胞，如圖4所示。

3.6 RT-PCR檢測真核表達質粒的轉染情況 轉染成功后的細胞用Trizol裂解，提取細胞總RNA，RT-PCR，以cDNA作為模板，用P1，P2作為引物進行PCR檢測。電泳位置在552 bp處觀察到目的條帶，說明pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ已轉染成功，如圖5所示。

1：重組質粒的pEGFP-Ⅰ-IFN-γ轉染結果圖4 重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ的轉染結果

M：DNA 分子質量標準；1：陰性對照;2:Ⅰ-IFN-γPCR產物圖5 Ⅰ-IFN-γ基因的PCR擴增結果

3.7 鯉魚組織的PCR檢測 在試驗鯉魚中隨機挑選任意11尾，模板：組織基因組，陽性對照：KHV，圖6為試驗結果，11尾魚的檢測結果呈陰性，可以進行下一步試驗。

1：陽性對照；2-12：鯉魚組織DNA的PCR結果；M：DNA分子質量標準圖6 鯉魚組織PCR檢測結果

3.8 鯉魚血清中抗體水平ELISA檢測結果 注射前要進行一次采血，再向不同試驗組鯉魚注射分別注射對應的免疫劑，一免及二免后一周，三免后第一至三周，尾靜脈采血。通過間接ELISA法檢測注射免疫劑后鯉魚血清中的抗體水平。通過平均數和標準差的計算，最終得出表中數據。表2為結果。

表2 鯉魚血清抗體水平檢測(OD450)

依表所見，除了PBS組和空白組，其它各組鯉魚血清中均能檢測出KHV特異性抗體，免疫次數增多抗體水平隨之增加。三免后兩周，抗體水平達到峰值，之后趨于下降。增加質粒濃度抗體水平稍有增加，但不明顯。PBS組和空白組這兩組與注射重組質粒組的抗體水平差異明顯(P<0.05)。

根據間接ELISA檢測試驗結果繪制折線圖(圖7)，可知混合制劑pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ+pIRES-ORF81相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81抗體水平有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖7 各組的血清抗體水平折線圖

根據間接ELISA檢測試驗結果，繪制各組的抗體水平的曲線，得出的免疫劑量為5 μg時，就可達到較好的抗體水平，隨著免疫劑量的增加，抗體水平有所升高。

4 討論與小結

硬骨魚的干擾素具種屬特異性，某種魚的干擾素對其它魚類抗病毒無作用。目前，已經鑒定了干擾素Ⅰ型對許多病毒的反應[24]。其中重組斑馬魚、鯰魚[25]、草魚、虹鱒[26]的干擾素都具有抗病毒的活性。在抑制病毒復制方面，干擾素Ⅰ型扮演了重要角色，可誘導蛋白表達，抑制病毒mRNA翻譯，增加宿主細胞的抵抗力，并能夠在感染早期限制病毒傳播和擴散。在機體抗病毒的非特異性免疫應答中起重要作用。

以Ⅰ-IFN-γ的上述特性為依據，為了探索其是否適合作為免疫佐劑，與錦鯉皰疹病毒病的疫苗聯合使用，我們進行了體外細胞轉染實驗，以探究目的蛋白是否能在體外錦鯉鰭條細胞中表達，通過倒置顯微鏡觀察和RT-PCR檢測，重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ成功轉入了錦鯉鰭條細胞中，說明重組質粒pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ能在細胞中正確表達，為接下來的體內試驗提供參考依據。

體內試驗選用生長發育較快的幼魚，意在降低核酸疫苗的劑量，另外希望能讓外源基因在宿主體內大量表達。免疫的最佳用量可根據魚的大小不同進行調整。本試驗采取肌肉注射的免疫方法，將聯合免疫制劑pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ+pIRES-ORF81注射入試驗魚體內，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，聯合免疫制劑所產生的抗體水平更高，免疫效果更好。

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(編輯：陳希)

Immune Effect of Carp I-IFN-γ as Koi Herpesvirus Nucleic Acid Vaccine Adjuvants

YU Hui1, ZHANG Rui-xue1, WANG Hao1, ZHOU Jing-xiang1*, LIU Yan-hui2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.JilinProvinceFisheryScienceInstitute,Changchun130118,China)

Study on the carp Ⅰ-IFN-γ immune effect, on the basis ofⅠ-IFN mRNA gene sequence Genbank login, The eukaryotic recombinant plasmid pEGFP-N1-Ⅰ-IFN were constructed.Mixing recombinant expression plasmid and transfection reagents in several immune dose transfected carp muscle cells. The expression of recombinant expression plasmid pEGFP-N1-Ⅰ-IFN-γ in carp muscle cells were observed by fluorescent inverted microscope.By using the mixture of recombinant expression plasmidin several immune dose and pIRES - ORF81 injected Carp′s intramuscular and immunized once a week, three times in total. Blood was sampling before injection and serum was collected to detect antibody levels by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Two weeks after the third immunization,experiment result showed that antibody titer reach the highest level. Compared with pIRES - ORF81alone immune,antibody level of combined immunization increased obviously, but no significant difference was observed between them(P>0.05). Show that carp Ⅰ - IFN -γ have certain immune effectas koi herpesvirus immune adjuvant.

Ⅰ-IFN-γ; koi herpesvirus; nucleic acid vaccine pIRES- ORF81; immune effect

公益性行業專項-錦鯉皰疹病毒病核酸疫苗的研制及初步應用(106037-2016-2018)；國家現代農業產業體系項目(CARS-46-29)

于慧，碩士研究生，從事病毒分子學方面研究。

周井祥,E-mail:zhjxnd@126.com;劉艷輝，E-mail:liuyanhui9@163.com

2016-07-04

A

1002-1280 (2016) 08-0009-07

S852.6