高效液相色譜法測定動物性食品中馬波沙星殘留量的研究

賈國賓，蘇然平，劉欣，魏麗娟*，瞿紅穎，宋婷婷，耿智霞，賈興，魏占勇，黃顯會

(1.河北遠征藥業有限公司，石家莊050041；2.河北省獸藥工程技術研究中心，石家莊050041；3.華南農業大學，廣州510642)

高效液相色譜法測定動物性食品中馬波沙星殘留量的研究

賈國賓1,2，蘇然平1,2，劉欣1,2，魏麗娟1,2*，瞿紅穎1,2，宋婷婷1,2，耿智霞1,2，賈興1,2，魏占勇1,2，黃顯會3

(1.河北遠征藥業有限公司，石家莊050041；2.河北省獸藥工程技術研究中心，石家莊050041；3.華南農業大學，廣州510642)

建立了高效液相色譜法測定豬肝臟、肌肉、腎臟、脂肪等組織中馬波沙星殘留量的方法。以氧氟沙星為內標物，將經過前處理的樣品用高效液相色譜儀測定。經驗證，馬波沙星在肝臟、肌肉等組織中的濃度在0.02～10 μg/g范圍內呈良好的線性關系，r≥0.999；方法檢出限為0.01 μg/g，最低定量限為0.02 μg/g；在動物組織中以不同水平添加馬波沙星，其回收率均在70%～120%之間，批內變異系數≤10%，批間變異系數≤15%。該殘留檢測方法具有靈敏度高、準確度及精密度高等優點，滿足動物性食品安全檢測的要求。

高效液相色譜法；動物性食品；馬波沙星；殘留量

馬波沙星(Marbofloxacin)是一種動物專用的新型氟喹諾酮類抗菌藥，由瑞士羅氏公司研制。該藥在1995年首次在英國上市，先后被英國、法國、美國和歐洲批準用于牛呼吸道感染和大腸桿菌引起的急性乳房炎、豬的無乳綜合癥，以及犬、貓的胃腸道感染、呼吸道感染和泌尿道感染，具有抗菌譜廣，抗菌活性強的特征[1-3]。馬波沙星在動物體內分布廣泛，耐受性良好，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特征，且其生物利用度高，毒性低，被列為動物專用藥[4-6]。

近年來，隨著氟喹諾酮類藥物的普遍使用，其殘留檢測技術已被國內外廣泛研究，目前的檢測方法主要包括高效液相色譜法、液相色譜/串聯質譜法、毛細管電泳法、酶聯免疫法等[7-8]，還有許多中外文獻報道了同時測定多種氟喹諾酮類藥物殘留的研究[9-11]。但具體針對馬波沙星在動物性食品中的殘留檢測技術研究較少。馬波沙星注射液作為一種新獸藥，其研制用于治療母豬乳腺炎-子宮炎-無乳綜合癥，為了客觀、科學地評價馬波沙星注射液在豬體內的殘留消除規律，制定合理的臨床給藥方案，并且為了保證動物性食品的質量安全性，建立了馬波沙星在豬組織中殘留檢測的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 試驗設備 高效液相色譜儀(DIONEX Ultimate 3000，戴安)；分析天平(AE160，Mettler)；離心機(Mach 1.6R，Thermo)；旋渦混合儀(MSI，IKA)；多功能振蕩器(HS250 Basic，IKA)；氮氣濃縮儀(TurboVap LV，Zymark)；可調微量移液器(Eppendorf Research，EPPENDORF)。

1.2 試劑 馬波沙星對照品(批號為Y0000819，購自歐洲藥典委員會)；乙腈(色譜純，Fisher公司)；水(符合GB/T 6682規定的二級水)；其它試劑均為國產分析純。

1.3 試液的配制

1.3.1 馬波沙星標準溶液 精密稱取適量的馬波沙星對照品，用適量乙酸溶解，甲醇稀釋，制成1000 μg/mL的馬波沙星標準貯備溶液；再分別量取適量的馬波沙星標準貯備溶液，用50%甲醇水溶液稀釋制成濃度系列為0.20、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL的馬波沙星標準工作溶液(4℃保存)。1.3.2 氧氟沙星(內標)標準溶液 精密稱取適量氧氟沙星標準品，用水溶解并稀釋制成500 μg/mL氧氟沙星標準貯備溶液；準確量取適量的氧氟沙星標準貯備溶液，用50%甲醇水溶液稀釋制成濃度10 μg/mL氧氟沙星(內標)標準工作液(4℃保存)。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：CNWsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶2%甲酸∶1%三乙胺∶水=18∶38∶38∶6(V/V/V/V)；流速：1 mL/min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：295 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。1.4.2 樣品處理 肌肉、腎臟、心臟、肺臟、注射部位、皮脂的提取方法：稱取1 g(±0.01 g)試樣(冷凍試樣應解凍至室溫)，置于50 mL離心管中。加入100 μL內標(氧氟沙星標準工作液，10 μg/mL)，靜置3 min，加入5 mL三氯甲烷，旋渦1 min，置搖床上300 r/min振蕩10 min后在4 ℃下離心。上清轉移至15 mL試管內。重復一次，合并上清液。上清液在45 ℃下N2吹干，用1 mL流動相復溶，渦旋，轉移上清液，正己烷除脂，離心后取適量溶液經0.22 μm濾膜過濾至樣品瓶中，供HPLC測定[12]。

肝臟的提取方法：稱取(1±0.01) g試樣(冷凍試樣應解凍至室溫)，同上述方法加入內標，靜置3 min，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，旋渦1 min，振蕩10 min，在4℃下10000 r/min離心10 min。上清轉移至50 mL離心管內。重復一次，合并上清液。加入適量氯化鈉，搖勻，再加入5 mL三氯甲烷，渦旋、振蕩、離心，轉移有機相至15 mL試管內，重復一次，合并有機相，45 ℃下N2吹干，用1 mL流動相復溶，渦旋，轉移上清液，正己烷除脂，離心后取適量溶液過濾，供HPLC測定。

1.4.3 測定法 根據試樣溶液中馬波沙星殘留量情況，進行標準曲線或單點校準。

1.4.4 空白試驗 除不加試驗藥品外，采用相同的方法進行平行操作。1.4.5 靈敏度 方法的靈敏度以檢測限和定量限表示。檢測限和定量限的測定方法為在空白組織中添加馬波沙星系列標準工作液，制成含馬波沙星藥物濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.10 μg/g的加標試樣進行測定，計算信噪比的平均值。以信噪比S/N=3時定為最低檢測限LOD，S/N=10時定為最低定量限LOQ(n=5)。

1.4.6 標準曲線和線性范圍 在50 mL的離心管中分別稱取1 g空白組織，依次加入一系列己知濃度的標準工作液，制成含馬波沙星濃度分別為0.02、0.05、0.15、0.3、0.5、1、2、5、10 μg/g、含氧氟沙星(內標)濃度為1 μg/g的組織樣品。按照組織樣品處理方法處理后，進樣分析。以測得的馬波沙星的峰面積與氧氟沙星(內標)的峰面積之比(S)與藥物濃度(C)作線性回歸，求標準曲線的回歸方程和線性相關系數。

1.4.7 回收率和變異系數測定 在1 g空白組織中加入馬波沙星標準工作液，制成含馬波沙星濃度為0.02、0.15、3.00 μg/g的肝臟、腎臟、肌肉組織樣品，添加濃度為0.02、0.15、1.00 μg/g的脂肪組織樣品。按照樣品處理方法處理后，進樣分析。每個濃度重復測定5次，以樣品中藥物峰面積與內標峰面積之比，求得低、中、高3種濃度的回收率，計算各組變異系數(CV%)，驗證方法的準確度與精密度。

2 結果

2.1 靈敏度 經過試驗測定，本方法最低定量限為0.02 μg/g，最低檢測限為0.01 μg/g，表明方法的靈敏度良好，滿足殘留檢測的要求。

2.2 標準曲線和線性范圍 試驗測得結果如表1中所示，在肝臟、肌肉、腎臟和脂肪組織中，馬波沙星濃度在0.02～10 μg/g范圍內線性關系均良好，各相關系數r≥0.999。

表1 組織樣品中添加馬波沙星的線性關系

2.3 回收率和變異系數測定 對添加不同濃度馬波沙星的組織樣品重復測定5次，其測定結果及計算所得的回收率與變異系數如表2至表5所示。由表中數據可知：在豬的肝臟、肌肉、腎臟組織樣品中，馬波沙星在0.02、0.15、3.00 μg/g三個添加水平上的回收率在70%～120%，批內變異系數CV≤10%，批間變異系數CV≤15%；在豬的脂肪組織樣品中，馬波沙星在0.02、0.15、1.00 μg/g三個添加水平上的回收率分別在70%～120%，批內、批間變異系數CV≤10%。證明方法的準確度與精密度良好。

表2 肝臟組織中馬波沙星的回收率和變異系數

表3 肌肉組織中馬波沙星的回收率和變異系數

表4 腎臟組織中馬波沙星的回收率和變異系數

表5 脂肪組織中馬波沙星的回收率和變異系數

3 討論

3.1 樣品前處理方法的優化 動物源食品中基質干擾復雜，富含脂肪和蛋白質等多種物質，選擇并優化樣品的前處理方法對結果的準確性尤為重要。本研究參考文獻[12]中的方法進行，對肌肉、腎臟、脂肪等組織樣品進行處理，但在提取肝臟樣品時發現提取出的樣品經過高效液相色譜檢測雜質較多，所以采用磷酸鹽緩沖液提取并離心取上清液的方法處理，實驗發現提取液磷酸鹽緩沖液的pH值對肝臟中馬波沙星藥物殘留檢測結果影響較大，未經pH調節時，肝臟中殘留檢測回收率不穩定，當提取液的pH值到7.4時，試驗結果較好。所以先用pH 7.4的磷酸鹽提取，離心取上清液，再以三氯甲烷萃取，可減少肝臟樣品中其他成分對檢測的干擾，并且經過檢測，此方法測得的樣品中馬波沙星藥物的回收率準確且穩定。

3.2 色譜條件的選擇與優化 馬波沙星為氟喹諾酮類藥物，結構式中含有羧基和哌嗪基，屬于酸堿兩性化合物，反相液相色譜分析時，色譜峰容易拖尾，通常選擇酸性溶液作為流動相的組成部分，同時還加入四丁基溴化銨或三乙胺等掃尾劑以獲得好的峰形。本試驗嘗試了乙腈、乙酸、甲酸、H3PO4、四丁基溴化銨、三乙胺、KH2PO4之間多種配比的流動相條件，經多次比較優化，綜合考慮色譜峰的峰值響應、保留時間以及與雜質峰的分離情況，選擇乙腈、甲酸與三乙胺的配比作為流動相，選擇的比例為乙腈∶2%甲酸∶1%三乙胺∶水=18∶38∶38∶6，此時色譜圖基線平穩、峰型良好，內標與馬波沙星的保留時間適宜，彼此能夠很好的分離且與基質中的雜質峰也能夠達到分離要求。

4 結論

本研究針對新獸藥馬波沙星注射液應用后在動物性食品中的殘量檢測，建立了高效液相色譜法。該研究具體針對馬波沙星注射液使用后，在豬的各組織中的殘留檢測建立了高效液相色譜方法。建立的方法為內標法，氧氟沙星作為內標物，其加入校準和消除了出于操作條件的波動對分析結果產生的影響，提高了測定結果的準確度。該方法可用于檢測豬肌肉、肝臟、腎臟及脂肪等多種組織中馬波沙星藥物的殘留，并且經試驗研究驗證，方法的靈敏度、準確度與精密度均良好，可用于動物性食品中馬波沙星殘留量的檢測。

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(編輯：陳希)

Determination of Marbofloxacin Residues in Animal Derived Food by HPLC

JIA Guo-bin1,2, SU Ran-ping1,2, LIU Xin1,2, WEI Li-juan1,2*, QU Hong-ying1,2, SONG Ting-ting1,2,GENG Zhi-xia1,2, JIA Xing1,2, WEI Zhan-yong1,2, HUANG Xian-hui3

(1.HebeiYuanzhengPharmaceuticalCo.,Ltd.,Shijiazhuang050041,China; 2.HebeiEngineeringResearchCenterofVeterinaryDrugs,Shijiazhuang050041,China; 3.SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)

A method based on high performance liquid chromatography (HPLC) has been developed for the determination of marbofloxacin in pig liver, muscle, kidney, fat and other tissues. After pretreatment, the tissue samples were analyzed by high performance liquid chromatograph with ofloxacin as an internal standard. The verified results were that: a good linear relationship was obtained for concentration range of 0.02～10 μg/g in the liver, muscle and other tissues (r≥0.999); the detection limit of the method was 0.01 μg/g and the lowest limit of quantification was 0.02 μg/g; in animal tissues, marbofloxacin was added at different levels and the recoveries were at the range of 70%～120%, the intra-assay coefficient of variation was ≤10% and the inter-assay coefficient of variation was ≤15%. The residue detection method had the advantage of high sensitivity, accuracy and precision and it could meet the safety test requirements of animal derived food.

high performance liquid chromatography; animal derived food; marbofloxacin; residues

賈國賓，高級工程師，從事藥物制劑方面的研究。

魏麗娟。E-mail：yuanchengcheng@sina.com

2016-01-25

A

1002-1280 (2016) 08-0039-05

S859.84