貂源肺炎克雷伯氏菌對小白鼠的致病性及其藥物防治研究

黃迪海，郭卉，王貴升，盛曉丹，黃兵，秦春芝，張從敬，劉霞，秦卓明,*

(1. 山東省健牧生物藥業(yè)有限公司 濟(jì)南 250100；2. 濟(jì)南市動物生物藥品工程技術(shù)研究中心 濟(jì)南 250100；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 濟(jì)南 250021； 4. 山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 濟(jì)南 250022)

貂源肺炎克雷伯氏菌對小白鼠的致病性及其藥物防治研究

黃迪海1,2，郭卉1,2，王貴升4，盛曉丹1,2，黃兵3，秦春芝1,2，張從敬1,2，劉霞1,2，秦卓明1,2,3*

(1. 山東省健牧生物藥業(yè)有限公司 濟(jì)南 250100；2. 濟(jì)南市動物生物藥品工程技術(shù)研究中心 濟(jì)南 250100；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 濟(jì)南 250021； 4. 山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 濟(jì)南 250022)

為評價貂源肺炎克雷伯氏菌(抗原型K2-5)的致病性和藥物防控效果，利用水貂和小白鼠分別進(jìn)行動物回歸試驗和半數(shù)致死量(LD50)毒力測定，旨在建立小白鼠致病模型。同時，按1 LD50劑量接種小白鼠，選用鹽酸洛美沙星分別按0.05(低)、0.2 mg/只(高)兩個不同的劑量進(jìn)行飲水預(yù)防和治療，同時設(shè)攻毒和健康對照，觀察、記錄和比較試驗結(jié)果。結(jié)果表明：該菌對小白鼠腹腔注射的LD50為6.29 CFU/0.3 mL。藥物試驗表明，高劑量組預(yù)防和治療效果顯著優(yōu)于低劑量組，預(yù)防組優(yōu)于單純的治療組，而攻毒組則100%發(fā)病，存活率僅為60%。該結(jié)果為臨床防控貂源肺炎克雷伯氏菌病提供了依據(jù)。

水貂；肺炎克雷伯氏菌；LD50；鹽酸洛美沙星；療效

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)為革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界，亦存在于健康人與動物的呼吸道和腸道中，是一種可以引起人和多種動物患病的條件性致病菌，可引起支氣管炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)和創(chuàng)傷感染、敗血癥、腦膜炎、腹膜炎等[1-2]。肺炎克雷伯氏菌毒力因子主要包括：莢膜多糖(K抗原)、Ⅰ型菌毛、脂多糖(O抗原)、鐵攝入能力等。莢膜多糖是肺炎克雷伯氏菌的主要毒力因子。根據(jù)莢膜多糖(K抗原)分型，可將肺炎克雷伯氏菌分為82個抗原型。其中K1、K2和K5型與人和動物體的嚴(yán)重感染性疾病有密切關(guān)系。

近年來，水貂感染肺炎克雷伯氏菌導(dǎo)致肺炎和敗血癥的病例逐漸增多，對水貂造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是危害貂僅次于大腸桿菌的第二大革蘭氏陰性菌，日益引起人們的關(guān)注[3-4]。由于肺炎克雷伯氏菌發(fā)病快、耐藥性強(qiáng)，對該病的防控十分困難。建立合適的動物致病模型，快速篩選出敏感藥物是控制該病的關(guān)鍵。本試驗結(jié)合臨床發(fā)病病例，從臨床藥物控制失敗的貂群中分離出一株肺炎克雷伯氏菌，在對其進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，評價了其對貂和小白鼠的致病性，構(gòu)建了小鼠發(fā)病模型，結(jié)合水貂用藥特點，篩選出鹽酸洛美沙星等敏感藥物，生物利用度高，預(yù)防和治療效果好，為臨床水貂克雷伯氏菌肺炎的防控提供了技術(shù)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株 肺炎克雷伯氏菌，分離自患肺炎的水貂，由山東省動物疫病預(yù)防與控制中心鑒定和分型，抗原型為K2-5型。

1.2 試驗動物 水貂(母)15只，420日齡，由濰坊諸城某養(yǎng)殖場提供。SPF級昆明小白鼠155只，雌雄各半，體重18～22 g，鼠糧及墊料若干；均由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)資質(zhì)SCXK(魯)20140007。

1.3 藥品與試劑 鹽酸洛美沙星可溶性粉，規(guī)格為2.5%，生產(chǎn)批號20150501，由山東省健牧生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。營養(yǎng)肉湯，批號20140705；營養(yǎng)瓊脂，批號：20150428，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。氨芐西林、阿莫西林、卡那霉素、林可霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、鹽酸洛美沙星、粘桿菌素B和慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)藥敏片，杭州濱和微生物試劑有限公司，批號：20150327。

1.4 儀器 超凈工作臺，型號：LCT-2DC-A，濟(jì)南綠之潔科技有限公司；恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，型號：HZQ-Q，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，型號DHP-420，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；手提式蒸汽滅菌器，型號：GMSX-260，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

2 方法

2.1 藥敏試驗 按照WHO推薦的Kirby-Bauer法[5]進(jìn)行藥敏試驗。

2.2 試驗菌液制備 菌種復(fù)蘇后劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落，接種于滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，37 ℃培養(yǎng)24 h；取培養(yǎng)液5 mL，接種于含普通營養(yǎng)瓊脂的2個克氏瓶中，37 ℃培養(yǎng)24 h；用營養(yǎng)肉湯70 mL洗脫菌苔，重懸，將菌液加入帶有玻璃珠的錐形瓶內(nèi)，37 ℃搖床振蕩1 h，即得試驗菌液；對試驗菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，接種普通營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)24 h，計數(shù)。

2.3 動物回歸試驗和小鼠致病模型建立 水貂組將試驗菌液按10-4、10-5、10-6、10-7四個梯度稀釋后，每個稀釋度菌液接種3只420日齡健康水貂，按0.3 mL/200 g體重的劑量腹腔注射作為試驗組，同時設(shè)置滅菌生理鹽水對照組。接種后每天觀察水貂發(fā)病情況，記錄分析菌株對水貂的致病性，病死水貂剖檢、分菌鑒定。小白鼠組將試驗菌液按10-5、10-6、10-7、10-8四個梯度稀釋后，每個稀釋度菌液接種5只小白鼠，腹腔注射劑量0.3 mL/只，同時設(shè)置生理鹽水對照組。攻毒后，每天觀察小白鼠發(fā)病和死亡情況，病死小白鼠剖檢，分菌鑒定。

2.4 LD50測定 試驗分7組，每組10只小白鼠，包括6個攻毒組和1個對照組。試驗小白鼠攻毒前12 h禁食，自由飲水。試驗菌液分別按10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11六個梯度稀釋，對小白鼠腹腔注射，注射劑量為每20 g體重0.3 mL；對照組腹腔注射相同劑量的滅菌生理鹽水。攻毒后連續(xù)觀察14 d，并統(tǒng)計死亡數(shù)據(jù)。按Karber法計算LD50，即logLD50=Xk-i(Σp-0.5)，其中Xk為最大劑量的對數(shù)，Σp為死亡率的總計，i為劑量對數(shù)的間距[5]。

2.5 藥物防治 試驗分6組，參考LD50數(shù)據(jù)，試驗菌液按LD50劑量攻毒。藥物防治分為預(yù)防組和治療組，預(yù)防組提前用藥2 d，攻毒后繼續(xù)用藥3 d；治療組攻毒后6 h開始用藥，連用3 d，小白鼠每天的飲水量按3 mL計算，全天飲用鹽酸洛美沙星水溶液，藥液每天更換；同時做陽性攻毒對照組和空白對照組(表1)。觀察記錄小白鼠發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計死亡率；死亡小白鼠剖檢，肉眼觀察病變，自肝臟、肺臟分菌鑒定。

表1 鹽酸洛美沙星對肺炎克雷伯氏菌感染小白鼠的防治試驗分組

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離和藥物敏感試驗 分離株耐藥性強(qiáng)，對氨芐西林、阿莫西林、卡那霉素、林可霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等常見的獸用抗生素耐藥，對鹽酸洛美沙星、粘桿菌素B、慶大霉素中敏。

3.2 水貂動物回歸試驗和小鼠疾病模型建立 試驗菌液活菌含量為3.15×1010CFU/mL。試驗組水貂在接種試驗菌液6 h后，各組水貂均表現(xiàn)為精神極度沉郁，臥地不起，急促喘氣，食欲廢絕，眼睛有大量分泌物等癥狀，個別出現(xiàn)腹瀉；10-4、10-7組24 h各死亡1只，另外10只也在48 h內(nèi)相繼死亡(表2)。剖檢可見肺臟出血，壞死，肝臟、腎臟表面有少量出血點，腸道無明顯變化。并再次從病死水貂肺臟、肝臟和大腦分離到該菌，表明該分離株對水貂有很強(qiáng)的致病性。

試驗菌液活菌含量為2.8×1010CFU/mL。小白鼠攻毒后6 h發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、站立不穩(wěn)、被毛逆立、呼吸急促等癥狀，采食量和飲水量減少。24 h后，小白鼠開始出現(xiàn)死亡，除10-8劑量組72 h死亡率80%外，其他3組均在48 h內(nèi)全部死亡(表2)。病死小白鼠剖檢，可見胸腔、肺臟有積液，肝臟腫大淤血，肺部有出血，腸壁充血、變薄；從病死小白鼠肝臟、肺臟中分離到該菌。小白鼠和水貂發(fā)病時間、發(fā)病癥狀和死亡率等相似。

3.3 LD50測定 試驗菌液活菌含量為3.15×1010CFU/mL。小白鼠攻毒后，立即表現(xiàn)為精神沉郁、呆立癥狀，30 min后恢復(fù)正常；10-11稀釋度試驗組無明顯癥狀，10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀釋度試驗組在攻毒后6 h開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、站立不穩(wěn)、被毛逆立、呼吸急促等癥狀，采食量和飲水量減少。10-6和10-7稀釋度試驗組小白鼠在3 d內(nèi)全部死亡；10-8稀釋度試驗組小白鼠在5 d內(nèi)全部死亡；10-9和10-10稀釋度試驗組小白鼠在7 d內(nèi)分別死亡7只和5只，剩余小白鼠14 d仍存活；10-11稀釋度試驗組小白鼠均存活(表3)。按Karber法計算，LD50為10-9.7/0.3 mL，LD50的95%可信區(qū)間為10-9.24～10-10.14/0.3 mL，即按1.89 CFU/只的劑量腹腔注射小白鼠，可使50%的小白鼠發(fā)生死亡。

病死小白鼠剖檢，可見胸腔、肺臟有積液，肝臟腫大淤血，肺部有出血，腸壁充血、變薄；從病死小白鼠肝臟、肺臟中分離細(xì)菌，經(jīng)鑒定，為肺炎克雷伯氏菌。

表2 各攻毒試驗組動物在不同時間的死亡率

表3 LD50試驗組小白鼠攻毒后的死亡情況

3.4 防治效果 小白鼠飲用鹽酸洛美沙星水溶液，無明顯毒副作用；小白鼠攻毒后的癥狀表現(xiàn)與LD50組一致，藥物防治組癥狀較輕；病死小白鼠剖檢，可見胸腔、肺臟有積液，肝臟腫大淤血，肺部有出血，腸壁充血、變薄；病死小白鼠肝臟、肺臟分菌，經(jīng)鑒定，為肺炎克雷伯氏菌。

鹽酸洛美沙星對貂源肺炎克雷伯氏菌人工感染的小白鼠具有一定的療效，其中，藥物預(yù)防高劑量組最佳，100%存活，預(yù)防低劑量組和治療高劑量組一致，存活率均為80%，治療低劑量組無明顯效果(表4)。治療組和陽性攻毒組死亡均發(fā)生在攻毒后3 d內(nèi)，之后均存活；預(yù)防低劑量組死亡發(fā)生在1 d內(nèi)，之后均存活且癥狀恢復(fù)正常，表明藥物預(yù)防組小白鼠攻毒后在較快時間內(nèi)恢復(fù)健康。

表4 鹽酸洛美沙星對克雷伯氏菌感染小白鼠的防治效果

4 討論

國內(nèi)外已有學(xué)者報道過肺炎克雷伯氏菌對小白鼠的半數(shù)致死量，L. Kristopher Siu等[6]測定了15株人源分離株的腹腔注射LD50，分別從<102～ 3.5×105CFU/只；Shankar-sinha Sunita等[7]測定了人源野生型分離株和O抗原缺失株的氣管攻毒LD50，分別是2×103CFU/只和6×104CFU/只；張詩渝[8]測定了鼠分離株KPm0912與標(biāo)準(zhǔn)株KP1300的皮下注射LD50，分別為5.5×104CFU/只 和6.5×105CFU/只；郝中香等[9]測定了四株扭角羚分離株的腹腔注射LD50，最強(qiáng)株是2.9×107CFU/只；馬磊等[10]從竹鼠中分離的克雷伯氏菌腹腔注射的半數(shù)致死量為4.5×107CFU/只；鐘世勛[11]從毛皮動物分離的肺炎克雷伯氏菌K1腹腔注射的LD50為3.06×107CFU/只；王劍等[12]從水貂中分離的兩株克雷伯氏菌KP-ZC1和KP-ZC2的腹腔注射LD50分別為9.8×105CFU/只、6.2×105CFU/只；李富祥等[13]從仔豬中分離的KP14013株對小白鼠腹腔注射的LD50為3×101.8CFU/只。本試驗菌株(K2-5型)對小白鼠腹腔注射LD50為1.89 CFU/只，毒力明顯強(qiáng)于上述報道。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，菌株培養(yǎng)6代以后，致病性顯著下降，100 CFU腹腔注射，小白鼠死亡率為0，劑量增大至10000 CFU時，小白鼠死亡率才能達(dá)到100%，原因可能是傳代造成毒力因子的丟失，有待進(jìn)一步研究。

動物回歸試驗發(fā)現(xiàn)，貂源肺炎克雷伯氏菌按每200 g體重0.3mL腹腔注射3.15×103CFU，48 h可導(dǎo)致水貂100%死亡，證實了該菌是引起水貂肺炎和大量死亡的病原。再次從病死水貂的腦組織中分離到該菌，說明該菌能通過血腦屏障，對于其致病機(jī)理的研究和防控具有重要的借鑒作用。

鹽酸洛美沙星屬于氟喹諾酮類抗菌藥，其抗菌機(jī)理是抑制DNA回旋酶的A亞單位的切割及封口活性，阻礙細(xì)菌DNA合成而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，該藥物對細(xì)菌選擇性高，不良反應(yīng)少，口服吸收好，生物利用度為85%，血藥濃度高而持久，t1/2約7 h，每日給藥一次即可[14]。粘菌素B和慶大霉素內(nèi)服用藥很少吸收[15]，適合注射使用。水貂攻擊性強(qiáng)、捕捉難度大，在規(guī)模化養(yǎng)殖條件下，應(yīng)優(yōu)先選擇全群防治、口服用藥的疫病防控措施。本試驗證實了混飲使用鹽酸洛美沙星對感染肺炎克雷伯氏菌的小白鼠具有良好的防治效果，有助于進(jìn)一步研究該藥物對水貂感染肺炎克雷伯氏菌的防治效果，為經(jīng)濟(jì)動物專用藥物的研制和應(yīng)用提供參考。

肺炎克雷伯氏菌對洛美沙星等氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制是：編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrA 基因及編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC基因變異，導(dǎo)致DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象發(fā)生變化，使藥物不能與酶-DNA復(fù)合物穩(wěn)定結(jié)合，起不到阻止細(xì)菌DNA合成的作用[15]；ram A基因過度表達(dá)可能促進(jìn)Acr AB外排系統(tǒng)表達(dá)增加，從而導(dǎo)致肺炎克雷伯氏菌對氟喹諾酮類耐藥性增加[16]。因此，在氟喹諾酮類藥物應(yīng)用的同時，應(yīng)注意監(jiān)測肺炎克雷伯氏菌耐藥基因的變化。

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(編輯：陳希)

Pathogenicity and Medicine Treatment ofKlebsiellapneumoniaefrom Mink in Mice

HUANG Di-hai1,2, GUO Hui1,2, WANG Gui-sheng4, SHENG Xiao-dan1,2, HUANG Bing3,QIN Chun-zhi1,2, ZHANG Cong-jing1,2, LIU Xia1,2, QIN Zhuo-ming1,2,3*

( 1．ShandongJianmuBiologicalPharmaceuticalCo.,Ltd,Jinan250100,China; 2．JinanEngineeringTechnologyResearchCenterforAnimalBiologics,Jinan250100,China; 3．InstituteofPoultryScience,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan250100，China;4.ShandongProvincialCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Jinan250022，China)

15 minks and 155SPF Kunming mice were inoculated in order to assess the pathogenicity and medicine treatment ofKlebsiellapneumoniae(K2-5 antigen)from minks as well as to establish a mouse model of pathogenic. Firstly, the median lethal dose (LD50) in mice was evaluated by intraperitoneal inoculation using Karber method, and the LD50was 6.29 CFU/0.3 mL. Then, only one LD50dose ofKlebsiellapneumoniaewas challenged with mice, lomefloxacin hydrochloride(LH) was selected as the medicine to prevent and control by drinking water at 0.5 mg or 2.0 mg dose against the K2-5 antigen type ,respectively. Furthermore, the establishment of the bacteria injected group and the blank group as the healthy control, which were also observed, recorded and compared. The results show that the preventive and therapeutic effect of high dose group is better than that of low dose group, prevention group is better than that of single treatment group, while, the bacterial inoculation group is 100% morbidity and survival rate is only 60%. The results provide a basis for the clinical prevention and control of mink sourceKlebsiellapneumoniabacteria.

mink;Klebsiellapneumoniae; LD50; lomefloxacin hydrochlorid; treatment

黃迪海，從事新獸藥研發(fā)方面工作。

秦卓明。E-mail: qinzm1997@163.com

2016-06-23

A

1002-1280 (2016) 08-0044-05

S852.6