提取動物組織DNA的方法比較

王戊騰，胡 鵬，安得霞

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

提取動物組織DNA的方法比較

王戊騰，胡 鵬，安得霞

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

傳統方式提取DNA大多運用氯仿、苯酚以及異丙醇等其他相關的試劑，此提取DNA的方式純度相對而言比較低，實驗過程非常的復雜、耗時之多，并且還有可能產生毒性的物質。所以，運用商品化的試劑盒針對DNA進行提取，顯得更加的簡潔、便利。本文首先介紹了試劑盒提取DNA方法的相關內容，并以兩種動物組織DNA提取方法的比較為具體的案例進行了分析。

DNA提取試劑盒；DNA；改進

1 引言

DNA是構成基因最主要的部分，在某個生物群體里面往往會共同具備著兩個或者多個不持續的基因型、變異型以及等位基因等被叫做基因的多態性，其有著非常多的種類，例如：DNA序列的多態性、DNA長度的多態性以及單核苷酸的多態性等。

2 試劑盒提取DNA簡介

2.1 基因組DNA提取的原則

確保核酸一級架構的整體性 (由于所有的遺傳信息都儲藏于核酸一級架構里面，因此較為全面的一級架構是確保核酸功能與結構分析的基石)。

排除其他類型的分子(例如：多糖、蛋白質以及脂類等)所造成的污染，使得接下來的實驗能夠成功地完成。

2.2 動物基因組DNA提取的方法

2.2.1 損傷性取樣材料DNA的提取

2.2.1.1 乙醇保存的動物標本基因組DNA提取方式用乙醇保存動物標本是最為常見、效果最好的方式。因為大部分的DNA酶必須具備某個二價陽離子當做輔助的因子(例如：Ca2+、Mg2+等)，在70%的乙醇里面倒入合適數量的EDTA，EDTA能夠在較短的時間內調控住DNA酶的活性，從而避免DNA所發生的降解。莫邦輝等人在酒精標本DNA模板迅速提取里面并未運用蛋白酶 K，只有在緩沖液 (0.5%SDS，10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/LEDTA，pH 8.0)，37℃溫浴1h之后消化相關的材料，同樣得到了比較好的擴增效果，然而這樣的方式只能夠運用片段比較短的PCR擴增中去。通常而言，使用酒精標本提取DNA的方式均會加入一定量的蛋白酶K，同時56℃的溫度之下消化8～14 h，以使得組織里面所含有的蛋白質全部消化。

2.2.1.2 甲醛溶液保存的動物基因組DNA提取方式在之前所進行的探索里面針對福爾馬林標本的DNA提取方式做出了非常大的改善，在標本的預先處理過程中，主要有臨界點干燥與梯度酒精浸泡這兩種不同的形式。然而梯度酒精浸泡的方式造成乙醇和標本里面的甲醛發生反應形成縮醛與半縮醛等，接著經過酒精變換被過濾出去。徐來祥等人為了避免標本吸入較多的水分而導致細胞被損害，運用PBS溶液融合乙醇溶液對樣品進行浸泡、洗脫，同樣獲得了比較好的成果[1]。在針對DNA進行提取的環節里面，周美玉與杜世章等人均均采取了抗氧化劑二硫蘇糖醇(DTT)，DTT可以非常好的避免甲醛氧化成甲酸，然而甲酸同樣會導致DNA出現降解，所以抗氧化劑的通入對于DNA的提取有著非常重要的意義。

2.2.2 非損傷性取樣材料DNA的提取

2.2.2.1 從毛發里面提取DNA的方式 從毛發里面獲得DNA，與其有關的報道非常之多。余艦等人在蛋白酶K的作用之下，運用酚-氯仿反復抽提的形式便已由毛發里面獲得極少數的DNA。徐艷春與伍新堯等人采取Chelex-100處理毛發提取DNA，然而運用這樣的方式對于毛囊細胞的裂解并不充分，所遺留的消化液對于之后所進行的PCR實驗有非常的負面影響[2]。之后，李軍林等人以普通的酚-氯仿提取方式為基礎進行改善，以pH 8.8Tris-HCl、MgCl2溶液與蛋白酶K作為裂解液進行消化，得到了品質比較高的DNA[3]。

2.2.2.2 從血液樣本里面提取DNA的方式 從血液里面取得DNA最為重要的便是清除掉里面所含有的蛋白質與紅細胞等其他物質。通常所采取的方式為∶首先獲得淋巴細胞，接著運用蛋白酶K、SDS進行消化，接著采取酚氯仿抽提進行提取、使用乙醇進行沉淀。然而這樣的方式比較繁瑣，同時所使用的試劑對于人們的健康有著較大的影響，因此有大量的專業人士對其作出了改善。趙權等人運用TritonX-100來對白細胞與紅細胞進行破碎，直接獲得白細胞核，接著運用Na-ClO4，SDS分解聚核蛋白，然而并未運用蛋白酶K，最終運用PCl(酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1)進行抽提，使用乙醇進行最后的沉淀。這樣的方式能夠更加好的去除紅細胞[4]。

3 試劑盒提取DNA的步驟

3.1 開展試驗之前所需要注意的幾點

首次運用之前需要根據試劑瓶外所貼的標簽指示首先在漂洗液PW與緩沖液GD里面倒入適量的無水乙醇。所選取的樣品需要防止重復此能夠的冷凍與溶化，不然會造成所提取出的DNA片段相對較小，提取的數量減低。如果緩沖液GB或者GA里面有沉淀物，能夠將其置入56℃的水浴里面再次溶解，搖勻之后繼續運用。全部的離心過程都需要運用臺式的離心機，在室溫背景下進行離心。

3.2 具體的操作步驟

3.2.1 處理相關的材料

3.2.1.1 如果所提取的材料是血液，能夠直接運用200μL冷凍、新鮮或者是融入各式各樣抗凝劑的血液，如果沒有200μL能夠加入適量的緩沖液GA進行補充。

3.2.1.2 若所需處理的血樣是鳥類、禽類以及兩棲類等其他更加低級生物的抗凝血液，他們的紅細胞是有核細胞，所以處理量在5～20μL的范疇以內，能夠加入緩沖液GA達到200μL之后實施以下的裂解過程。

3.2.1.3 由貼壁培養所獲得細胞首先需要處理成細胞懸液，10 000 rpm(-11 200×g)離心1 min，去處上清，倒入200μL緩沖液GA，不停的振蕩直到完全的懸浮。

3.2.1.4 動物組織（脾組織的用量需要低于10 mg）首先需要打碎成細胞懸液，接著放入10 000 rpm(-11 200× g)離心1 min，去處上清，倒入200μL緩沖液GA，不停的振蕩直到完全的懸浮。

3.2.2 倒入20μL的蛋白酶K溶液，搖晃均勻

3.2.2.1 在提取血液基因組的時候，僅僅需要加入蛋白酶K搖晃均勻，便能夠進入一下道程序。

3.2.2.2 在提取細胞基因組的時候，僅僅需要加入蛋白酶K搖晃均勻，便能夠進入一下道程序。

3.2.2.3 在提取組織基因組的時候，加入蛋白酶K搖晃均勻之后，進行56℃水浴，直到所有的組織全部溶解，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內部的水珠，再進入下一道程序。

3.2.3 倒入200μL的緩沖液GB，全面顛倒使其均勻，在70℃中擱置10 min，溶液變得非常的清亮，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內部的水珠。

3.2.4 倒入200μL的無水乙醇，全面振蕩混勻15 s，這個時候或許會形成絮狀的沉淀物，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內部的水珠。

3.2.5 將以上所獲得的溶液與絮狀的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接著再將吸附柱置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.6 往吸附柱CB3里面倒入500μL的緩沖液GD（在運用之前首先需要檢驗是不是已經倒入了無水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.7 往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW（在運用之前首先需要檢驗是不是已經倒入了無水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.8 重復執行步驟7。

3.2.9 把吸附柱CB3置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，過濾廢液。把吸附柱CB3放入室溫里面幾分鐘的時間，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液。

3.2.10 把吸附柱CB3轉移到其他未使用過的離心管里面，接著往吸附膜的中間區域懸空滴入50～200 μL的洗脫緩沖液TE，室溫擺放2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，將所有的溶液采集到離心管里面。

4 兩種動物組織DNA提取方法的比較

4.1 材料與方法

4.1.1 實驗材料

4.1.1.1 試驗樣本 此次試驗所運用的豬肉組織都源自于在售的新鮮動物，在完成樣品收集之后儲藏在-80℃的冰箱里面。

4.1.1.2 試驗試劑以及相關的設備 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；微型離心機（杭州米歐儀器有限公司）；FA2004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；SP-1900UV型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

4.1.2 實驗方法

4.1.2.1 酚-氯仿抽提 一是取50 mg豬肉組織剪碎之后置入1.5 mL的離心管里面，倒入400μL的裂解液、200μL的lSDS以及20μL的蛋白酶K，經過56℃的水浴消化之后過夜處理；二是往里面加入相同體積的飽和酚，充分搖晃5～6 min，靜靜的擱置5 min，12 000 r/min離心10 min；三是細致的提取上清部門轉移到全新的1.5 mL的離心管里面，融入相同體積的體積比是25飽和酚∶24氯仿∶1異戊醇，充分搖晃至均勻，靜靜的擱置4～5 min，12 000 r/min離心10 min；四是細致的提取上清部門轉移到全新的1.5 mL的離心管里面，融入相同體積的體積比是24氯仿∶1異戊醇，充分搖晃至均勻，靜靜的擱置4～5 min，12 000 r/min離心10 min；五是細致的提取上清部門轉移到全新的1.5 mL的離心管里面，倒入2倍的無水乙醇，（無水乙醇需要提前擺放于-20℃的環境中冷凍5～10 min），12 000 r/min離心10 min；六是排除無水乙醇，倒入1 mL的75%乙醇，反復吹打，12 000 r/min離心10 min，此步驟需要重復1次；七是通風、干燥5～10 min，倒入50μL的純水。

4.1.2.2 試劑盒提取 一是取50 mg豬肉組織剪碎之后置入1.5 mL的離心管里面，融入200μL的緩沖液GA，倒入20μL蛋白酶K搖晃均勻之后，進行56℃水浴，直到所有的組織全部溶解；二是倒入200μL的緩沖液GB，全面顛倒使其均勻，在70℃中擱置10 min，溶液變得非常的清亮，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內部的水珠；三是倒入200μL的無水乙醇，全面振蕩混勻15 s，這個時候或許會形成絮狀的沉淀物，簡單的離心以清除懸掛在管蓋內部的水珠；四是將以上所獲得的溶液與絮狀的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接著再將吸附柱置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面；五是往吸附柱CB3里面倒入500μL的緩沖液GD（在運用之前首先需要檢驗是不是已經倒入了無水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面；六是往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW（在運用之前首先需要檢驗是不是已經倒入了無水乙醇），12 000rpm（～13 400×g）離心30 s，過濾掉廢液，把吸附柱CB3置入收集管里面，重復再做一次；七是把吸附柱CB3置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，過濾廢液。把吸附柱CB3放入室溫里面幾分鐘的時間，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液；八是把吸附柱CB3轉移到其他未使用過的離心管里面，接著往吸附膜的中間區域懸空滴入150μL的洗脫緩沖液TE，室溫擺放2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）離心2 min，將所有的溶液采集到離心管里面。能夠直接開展PCR反應。

4.1.3 DNA濃度與純度的檢測

運用核酸蛋白定量儀檢測DNA樣品的OD260、OD280吸光度具體數值同時測定DNA的濃度與純度（如表1所示）。

4.1.4 PCR擴增實驗

表1 兩種DNA提取方法的濃度及純度

豬cytb基因引物所設計的序列為：上游5′CACGACCAATGACATGAAAAATC3′，下游5′GCTGCGAGGGCGGTAAT3′。PCR的反應過程如下：PCR反應總體系是50μL，PCR反應組成成分主要有以下幾種：其間 10×Buffer 5μL，10 mmol/LdNTP 4μL, 12.5μmol/L上下游的引物均為1.5μL，ExTagDNA聚合酶2U，倒入超純水直到50μL。PCR所必備的反應條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，一共有35個重復過程，最終72℃延伸10 min，溫度降調4℃儲藏。御用酚-氯仿抽提的方式所獲得的DNA置入4℃的溫度中儲藏3～5 d之后，進行PCR擴增。采取試劑盒所獲得的DNA能夠直接進行PCR擴增。

4.1.5 瓊脂糖電泳檢測

4.1.5.1 基因組DNA的檢測 運用1%的瓊脂糖電泳檢查兩種方式所提取出的DNA，見圖1。

圖1 兩種方法提取的基因組DNA電泳結果比較

4.1.5.2 PCR擴增的檢測 運用1%的瓊脂糖電泳檢查擴增的結果，見圖2。

4.2 結果

4.2.1 DNA純度、濃度的測定結果 從以上兩種方式所測得的DNA純度層面來看，酚-氯仿抽提是1.58±0.18，試劑盒提取法是1.74±0.15，兩者之間的差距非常明顯（P＜0.05），試劑盒所提取出的DNA純度更加接近于1.8。從DNA的濃度層面來看：酚-氯仿抽提法時120±25μg/mL，試劑盒提取法是112±11μg/mL，兩者之間沒有太大的差距。

圖2 兩種方法的cytb基因PCR擴增

4.2.2 DNA瓊脂糖電泳結果 瓊脂電泳檢測DNA帶型相對比較聚集、整齊（如圖1所示），表明以上兩種方式所提取獲得的基因組DNA都是非常全面的、無降解的。

4.2.3 PCR擴增后結果 圖2所代表的是cytb基因經過PCR擴增之后的效果，此兩種不同的方式所提取得到的基因組DNA均能夠當作PCR擴增所需的模板，同時均有著非常好的擴增成效。

5 結論

使用試劑盒進行提取非常的迅速、便利，相同樣品的操作與比酚-氯仿抽提相比少用了非常少的時間。使用試劑盒進行提取防止運用含有毒性的氯仿與苯酚等其他相關的試劑，避免了具體操作環節里面對于工作人員自身的健康造成傷害。使用試劑盒所提出的DNA產量相對較高，純度較好，能夠直接運用于PCR與其他的酶切試驗中去。

因為試劑盒提取的方式運用了離心柱，防止了多次重復性的換管，節約了大量的資源，離心的時間較少，離心只需要在室溫下就能夠完成，避免對離心機造成損害，同時采取試劑盒進行提取是綠色無污染的。試劑盒提取具備較強的重復性、平穩的結果以及較高的成功率等優點，減少了提取所需要的費用，比較適合用于大量DNA的提取。

[1]徐來祥,張知彬,宋銘晶,等.福爾馬林保存的動物標本基因組DNA的提取方法[J].動物學報(Current Zoology), 2002,48(2)∶264-269.

[2]徐艷春,馬立新,白素英,等.應用PCR方法通過毛發進行哺乳動物性別鑒定[J].東北林業大學學報,2000,28(6)∶72-77.

[3]李軍林,加建斌,舒青,等.非損傷性取樣在珍稀瀕危鳥類——朱翾種群遺傳學中的應用[J].榆林學院學報,2001,11 (2)∶37-39.

[4]唐斯,王大明,李楨,等.兩種從陳舊血中抽提基因組DNA方法的比較[J].實驗與檢驗醫學,2007,25(5)∶423-425.

（編輯：趙鵬飛）

S813

B

1006-799X(2016)23-0087-04

王戊騰（1992-），女，河北保定人，本科，研究方向為分子生物學。