慢性阻塞性肺疾病患者外周血Th17/CD25+Foxp3+Treg比率的變化

何燕超， 揭志軍， 施勁東， 梅周芳， 錢 凌， 黃琦慧， 鄢莉宏

復旦大學附屬上海市第五人民醫院呼吸內科，上海 200240

論 著

慢性阻塞性肺疾病患者外周血Th17/CD25+Foxp3+Treg比率的變化

何燕超， 揭志軍， 施勁東， 梅周芳， 錢 凌， 黃琦慧， 鄢莉宏*

復旦大學附屬上海市第五人民醫院呼吸內科，上海 200240

目的：研究慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者外周血中CD25+Foxp3+Treg和Th17細胞介導的免疫失衡與該疾病進展之間的相關性。方法：選擇2012年1月至2015年3月在上海市閔行區江川社區及復旦大學附屬上海市第五人民醫院接受門診或住院治療的穩定期和急性發作期COPD患者共69例，同時收集吸煙或不吸煙的健康對照者各20例。測定受試者的肺功能。采用流式細胞術測定受試者外周血中Th17和CD25+Foxp3+Treg占CD4+細胞的百分比，分析Th17/CD4+和CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率以及Th17/CD25+Foxp3+Treg比值在不同分組中的變化及其臨床意義。結果：與健康對照組相比，穩定期COPD患者外周血中Th17/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg明顯升高(P<0.05)，而CD25+Foxp3+Treg/CD4+明顯降低(P<0.05)；急性發作期COPD患者的Th17/CD4+、CD25+Foxp3+Treg/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg均比對照組明顯升高(P<0.05)。輕度、中度、重度和極重度的COPD患者中Th17/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg逐步升高(P<0.05)，而CD25+Foxp3+Treg/CD4+逐步降低(P<0.05)；COPD患者的Th17/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg與肺功能負相關(P<0.05)，CD25+Foxp3+Treg/CD4+與肺功能正相關(P<0.05)。結論：Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡參與了COPD的疾病進展過程，提示Th17/CD25+Foxp3+Treg免疫調節治療可能成為COPD治療的新途徑。

慢性阻塞性肺疾病；免疫調節；Th17細胞；T淋巴細胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續氣流受限為特征的可以防治的呼吸系統疾病。近年來，COPD的發病率和病死率居高不下，成為備受關注的疾病之一[1]。越來越多的研究證明，CD4+T細胞在COPD相關的慢性炎性反應中發揮作用[2]。輔助性T 細胞17(T helper cell 17，Th17)是CD4+T細胞的一種亞型。在轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的作用下， CD4+T細胞可以表達核孤兒受體家族成員RORγt并向Th17分化，隨后分化成熟的Th17分泌細胞因子IL-17A，從而發揮生物學效應[3]。調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)是CD4+T細胞的另一種亞型，它是一種重要的免疫調節細胞。Treg中異位表達的叉頭翼狀螺旋轉錄因子p3(forkhead or winged helix transcription p3，Foxp3)可以通過接觸抑制、分泌抑制性因子IL-10和TGF-β，維持免疫環境的穩態[4]。Th17/Treg平衡是Th1/Th2經典模型的補充，Th17/Treg平衡在機體免疫應答和免疫耐受中具有重要作用[5]。因此，本研究通過檢測各個階段的COPD患者外周血中Th17/CD25+Foxp3+Treg的百分比，探討COPD的免疫學發病機制，并試圖尋找可以干預COPD進展的有效靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2015年3月在上海市閔行區江川社區及復旦大學附屬上海市第五人民醫院接受門診或住院治療的COPD患者69例。所有病例均符合中華醫學會呼吸病學分會制定的診斷標準[1]，且均不合并支氣管哮喘、其他肺部疾病、心力衰竭及自身免疫性疾病。除19例急性發作期COPD(acute exacerbation of COPD，AECOPD)患者外，所有50例穩定期COPD(stable COPD，SCOPD)患者均完成肺功能檢查，相關指標包括一秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、FEV1占預計值的百分比(EFV1%pred)、FVC占預計值的百分比(FVC%pred)以及FEV1/FVC比率。根據COPD全球策略(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD)的分級標準(依據肺功能評估氣流受限程度)，將SCOPD患者分為GOLD1級(輕度)11例、GOLD2級(中度)14例、GOLD3級(重度)11例和GOLD4級(極重度)14例。同時，收集在本院體檢中心進行體檢的非吸煙健康志愿者及肺功能正常的吸煙者各20例，作為對照組；所有對照均不合并其他疾病。本研究方案經上海市第五人民醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。所有入組患者及對照的具體臨床資料見表1。

1.2 主要試劑和設備 流式細胞術使用的所有抗體以及細胞刺激培養所需的豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素、布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)和Fix&Perm Kit Reagent均購自美國BD公司；淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque)購自美國Sigma公司；人Treg染色試劑盒購自美國eBioscience公司。流式細胞儀(FACScalibur)購自美國BD公司。

1.3 標本收集與處理 采集受試者外周血3 mL，置入肝素鋰抗凝管內。將外周血用0.9%氯化鈉溶液等倍稀釋后，將其沿離心管邊緣輕輕加至Ficoll-Hypaque分離液上面，室溫500×g離心20 min，分離白膜層細胞即為外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。用RPMI 1640培養液洗滌細胞3～5次后，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞密度為1×106個/mL，將細胞鋪至24孔板中培養，用于流式細胞學檢測。

1.4 流式細胞術檢測Th17/CD4+細胞比率 將細胞密度為1×106個/mL的新鮮PBMC接種于24孔板，每孔100 μL，然后分別加入1 μg/mL離子霉素、50 ng/mL PMA和1 μg/mL BFA，于37℃和5% CO2條件下培養細胞6 h。分別加入PE標記的鼠抗人CD8單克隆抗體和FITC標記的鼠抗人CD3單克隆抗體，4℃避光反應30 min，用PBS緩沖液洗滌。用固定破膜試劑盒(Fix & Perm Kit)中的Reagent A固定，Reagent B破膜，然后加入APC標記的鼠抗人IL-17A單克隆抗體或同型IgG1標記的細胞內抗體，4℃避光反應30 min，用PBS緩沖液洗滌。最后用0.4 mL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測CD3+CD8-IL-17A+細胞(即Th17)占CD3+CD8-細胞(即CD4+T細胞)的百分比(簡稱Th17/CD4+比率)；每次檢測均設立同型對照。

參數對照組非吸煙者吸煙者SCOPD組輕度中度重度極重度AECOPD組n20201114111419年齡(歲)64±566±765±666±466±468±568±5性別(男/女)16/420/09/212/210/110/415/4吸煙指數0480532677562554637FEV1/L3．2±0．52．8±0．1a2．1±0．3ab1．8±0．2abc1．2±0．1abcd0．8±0．1abcde?FEV1%pred/%101．8±4．099±2．3a87．1±5．7ab64．5±8．8abc40．0±6．5abcd25．1±3．5abcde?FVC/L3．8±0．63．6±0．23．2±0．4ab3．0±0．5ab2．6±0．5abcd2．1±0．6abcde?FVC%pred/%103．0±4．4101．6±3．191．2±6．9ab90．3±10．1ab77．3±2．9abcd73．5±7．4abcd?FEV1/FVC/%85．9±5．480．1±3．3a67．3±1．8ab58．7±6．9abc49．5±9．6abcd37．8±9．0abcde?

aP<0.05與非吸煙者比較；bP<0.05與吸煙者比較；cP<0.05與輕度COPD組比較；dP<0.05與中度COPD組比較；eP<0.05與重度COPD組比較。吸煙指數=每天吸煙支數×吸煙年數，所有COPD組中戒煙者的吸煙指數為戒煙前的吸煙指數；FEV1：1秒用力呼氣容積；FVC：用力肺活量；FEV1%pred：1秒用力呼氣容積占預計值的百分比；FVC%pred：用力肺活量占預計值的百分比

1.5 流式細胞術檢測CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比率 將細胞密度為1×106個/mL的新鮮PBMC接種于24孔板，每孔100 μL，然后加入PE標記的鼠抗人CD25單克隆抗體和FITC標記的鼠抗人CD4單克隆抗體，4℃避光反應30 min，用PBS緩沖液洗滌。用Treg染色試劑進行破膜、固定，PBS洗滌、離心后，加入APC標記的鼠抗人Foxp3單克隆抗體及同型IgG1標記細胞內抗體，4℃避光30 min，用PBS緩沖液洗滌。最后用0.4 mL含1%多聚甲醛溶液的PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的百分比(簡稱CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率)；每次檢測設立同型對照。

2 結 果

2.1 受試者臨床資料分析 本實驗共納入受試者109例，其中對照組40例，SCOPD患者50例，AECOPD患者19例。在對照組中，吸煙者的FEV1、FEV1%pred和FEV1/FVC比率均低于非吸煙者，這說明吸煙可能引起肺功能下降。SCOPD組的FEV1、FEV1%pred和FEV1/FVC比率均低于對照組，并隨著COPD分級增加，肺功能逐步降低(表1)。

2.2 COPD患者外周血中Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡 為了探索Th17/CD25+Foxp3+Treg平衡在COPD發生及進展中的作用，本研究采用流式細胞術分析了對照組、SCOPD組和AECOPD組患者的外周血Th17和CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的百分率變化。結果(圖1、表2)顯示：與對照組相比，SCOPD組的CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率明顯降低(P<0.05)，AECOPD組的CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率明顯升高(P<0.05)，而SCOPD和AECOPD組的Th17/CD4+比率和Th17/CD25+Foxp3+Treg比值均明顯升高(P<0.05)。

圖1 各組受試者的CD25+Foxp3+Treg和Th17細胞流式檢測結果A: CD25+Foxp3+Treg/CD4+; B: Th17/CD4+

細胞對照組(n=40)SCOPD組(n=50)AECOPD組(n=19)Th17/%#0．95±0．272．3±1．07a3．48±0．75aCD25+Foxp3+Treg/%#4．11±0．792．62±1．11a5．25±1．37aTh17/CD25+Foxp3+Treg0．24±0．081．22±0．96a0．73±0．33a

#指Th17和CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的百分比.aP<0.05與對照組比較

2.3 Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡與SCOPD患者肺功能的關系 為了探討Th17/CD25+Foxp3+Treg與肺功能的關系，本研究將對照組分為非吸煙組和吸煙組，將SCOPD組按肺功能分為輕度、中度、重度和極重度組。分析發現，Th17/CD4+比率和Th17/CD25+Foxp3+Treg比值在吸煙組高于非吸煙組(P<0.05)，在SCOPD各組均高于非吸煙組(P<0.05)，并且隨著肺功能分級進展，Th17/CD4+比率和Th17/CD25+Foxp3+Treg比值均逐步升高(P<0.05)。CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率在吸煙組高于非吸煙組(P<0.05)，輕度組與非吸煙組差異無統計學意義，而中度組CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率低于輕度組和非吸煙組(P<0.05)，并且重度組和極重度組的CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率低于中度組(P<0.05，表3)。

細胞對照組非吸煙者(n=20)吸煙者(n=20)SCOPD組輕度(n=11)中度(n=14)重度(n=11)極重度(n=14)Th17/%#0．74±0．161．16±0．19a1．12±0．27a1．72±0．33abc2．74±0．48abcd3．54±0．80abcdeCD25+Foxp3+Treg/%#3．83±0．324．37±1．02a3．98±0．413．18±0．78abc1．75±0．19abcd1．66±0．61abcdTh17/CD25+Foxp3+Treg0．19±0．030．28±0．09a0．28±0．05a0．57±0．15abc1．57±0．19abcd2．35±0．87abcde

#指Th17和CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞的百分比.aP<0.05與非吸煙者比較；bP<0.05與吸煙者比較；cP<0.05與輕度COPD組比較；dP<0.05與中度COPD組比較；eP<0.05與重度COPD組比較

2.4 Th17、CD25+Foxp3+Treg、Th17/CD25+Foxp3+Treg與肺功能的相關性分析 本研究進一步分析SCOPD患者外周血Th17/CD4+、CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率、Th17/CD25+Foxp3+Treg比值與肺功能下降程度的相關性。結果發現，Th17/CD4+比率與FEV1%pred、FVC%pred和FEV1/FVC比率均負相關(P<0.05)；CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率與FEV1%pred、FVC%pred和FEV1/FVC比率均正相關(P<0.05) ；Th17/CD25+Foxp3+Treg比值與FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC比率也均負相關(P<0.05) 。這些數據說明，COPD患者體內Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡與肺功能下降有高度的相關性(表4)。

表4 外周血Th17和CD25+Foxp3+Treg與肺功能的相關性分析

3 討 論

COPD與氣管和肺組織對香煙煙霧等有害顆粒的異常慢性炎性反應有關[6-7]。這些有害顆粒不僅會引起上皮細胞損傷，激活固有免疫，而且會使機體自身的抗原性發生改變，進而激活特異性免疫。近期有很多研究顯示，香煙煙霧的刺激會激活T細胞免疫[8-9]。Treg對T細胞亞群的分化具有重要的調節作用，Treg表達Foxp3后對Th17有明顯的負向調節作用[4]。因此，研究Th17/Treg平衡在不同階段、不同程度COPD患者體內的變化具有重要的臨床意義。已有一些研究[10]發現，Th17/CD25+Treg平衡在SCOPD患者中有變化，但沒有研究Foxp3+Treg在COPD患者體內的變化。COPD患者的主要臨床表現為氣流受限呈進行性進展，肺功能的變化是COPD進展的重要指標。因此，本研究選取了健康對照人群、SCOPD患者及AECOPD患者作為研究對象，檢測各組外周血中Th17和CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細胞百分比的變化，分析Th17、CD25+Foxp3+Treg與肺功能的相關性，并從免疫學角度探索Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡在COPD發生及進展中的病理生理學機制。

本研究分析Th17、CD25+Foxp3+Treg在對照組、SCOPD組和AECOPD組的表達情況，結果發現SCOPD組的Th17/CD4+比率高于對照組，而CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率低于對照組；AECOPD組的Th17/CD4+和CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率均高于對照組。遂進一步分析Th17/CD25+Foxp3+Treg比值，發現SCOPD組和AECOPD組均高于對照組。這說明COPD患者體內處于Th17優勢狀態，AECOPD患者的CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率升高可能是由于COPD急性發作的情況下存在其他促CD25+Foxp3+Treg分化的因素(如感染等)。

為了進一步探索Th17/CD25+Foxp3+Treg在COPD中的作用，本研究將對照組分為非吸煙組和吸煙組，將不同嚴重程度的SCOPD患者按肺功能分級分為4組。分析發現，吸煙者的Th17/CD4+、CD25+Foxp3+Treg/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg均高于非吸煙者；并且，隨著COPD嚴重程度的進展，Th17/CD4+和Th17/ CD25+Foxp3+Treg在SCOPD組逐步升高；從中度COPD開始，CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率明顯下降，并隨著疾病進展逐步降低。表1數據顯示，吸煙者的FEV1%pred、FEV%pred和FEV1/FVC均低于非吸煙者；結果提示在COPD前期(FEV1%pred開始下降時)已經開始出現Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡，并且隨著肺功能下降，Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡逐步加重。Wang等[8]通過香煙煙霧刺激建立小鼠COPD模型，檢測不同肺功能階段小鼠Th17/CD4+和CD25+Foxp3+Treg/CD4+的變化，結果發現：短期香煙刺激的小鼠PBMC和肺部CD25+Foxp3+Treg、Th17均比對照組明顯增加，但是Th17/CD25+Foxp3+Treg無明顯變化；長期刺激的小鼠PBMC和肺部CD25+Foxp3+Treg比對照組明顯減少，Th17/CD25+Foxp3+Treg比對照組明顯升高。本研究結果與之類似。

從本研究臨床試驗和Wang等[8]的動物實驗結果可見，CD25+Foxp3+Treg的變化不同于Th17呈現一個穩步同方向的變化，而在吸煙組CD25+Foxp3+Treg所占比例相對于肺功能正常的非吸煙者出現了升高，呈現出一個波動的變化；這表明CD25+Foxp3+Treg可能在Th17/Treg平衡中起到單獨調節作用。已有研究證明，Treg細胞是體內重要的調節細胞，它可以通過接觸抑制和分泌IL-10而抑制Th17的分化及功能[10-12]。而Th17是一種促炎性反應細胞，它可分泌IL-6和IL-21等因子，激活STAT-3通路，抑制Foxp3的表達，進而抑制Treg分化[13-15]。因此，CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率在吸煙組出現升高，可能是由于CD25+Foxp3+Treg對Th17分化的抑制作用。COPD前期可能通過CD25+Foxp3+Treg/CD4+比率升高而抑制Th17分化，從而保護內環境穩態；但是隨著COPD進展，繼續升高的Th17反過來抑制CD25+Foxp3+Treg的調節作用，使內環境失衡；到COPD晚期，Th17/CD25+Foxp3+Treg完全失衡，Th17占絕對優勢。

本研究中，COPD患者的Th17/CD4+、CD25+Foxp3+Treg/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg隨著肺功能分級逐步變化，因此進一步分析COPD患者Th17、CD25+Foxp3+Treg和Th17/CD25+Foxp3+Treg與肺功能的相關性。結果顯示，Th17/CD4+和Th17/CD25+Foxp3+Treg均與FEV1%pred、FVC%pred及FEV1/FVC負相關，而CD25+Foxp3+Treg/CD4+與FEV1%FVC%pred及FEV1/FVC正相關。以上結果進一步說明，COPD患者體內Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡的過程與肺功能的下降程度高度相關。

綜上所述，Th17/CD25+Foxp3+Treg失衡參與了COPD患者疾病進展的過程，與肺功能下降高度相關，CD25+Foxp3+Treg對Th17/Treg平衡起到了重要的調節作用。本研究結果從免疫學角度為揭示COPD的病理生理機制提供了新的視角。同時，本研究也為Th17/CD25+Foxp3+Treg應用于臨床評估COPD的嚴重程度，指導COPD的治療方案提供了一定的理論依據。然而，本研究尚存在性別比率不均衡和樣本量小等不足，因此檢測Th17/CD25+Foxp3+Treg是否可以應用于評估COPD預后、指導COPD治療，還有待更完善的大樣本研究來明確。

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[本文編輯] 葉 婷， 張藝鳴

Change of Th17/CD25+Foxp3+Treg ratio in peripheral blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease and its significance

HE Yan-chao, JIE Zhi-jun, SHI Jin-dong, MEI Zhou-fang, QIAN Ling, HUANG Qi-hui, YAN Li-hong*

Department of Respiratory Medicine, Shanghai Fifth People’s Hospital, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective：To investigate the correlationship between peripheral CD25+Foxp3+Treg and Th17 cell-mediated immune imbalance and the progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods：A total of sixty-nine patients with COPD in stable stage or acute exacerbation of COPD were recruited from Shanghai Fifth People’s Hospital of Fudan University from January 2012 to March 2015.At the same time, the non-smokers and smokers with normal lung function, each 20 cases, were also used as the healthy controls.The pulmonary function of all subjects was evaluated.The percentages of Th17 and CD25+Foxp3+Treg cells in CD4+cells from peripheral blood were determined by flow cytometry.The changes of Th17/CD4+, CD25+Foxp3+Treg/CD4+and Th17/CD25+Foxp3+Treg ratios in the different groups and their clinical significance were analyzed.Results：Compared with the healthy control group, the ratios of Th17/CD4+and Th17/CD25+Foxp3+Treg in peripheral blood of patients with stable COPD were significantly increased (P<0.05), while the ratio of CD25+Foxp3+Treg/CD4+was significantly decreased (P<0.05).The ratios of Th17/CD4+, CD25+Foxp3+Treg/CD4+and Th17/CD25+Foxp3+Treg in patients with acute exacerbation of COPD were all increased as compared with the healthy control (allP<0.05).With the decline of lung function, the ratios of Th17/CD4+and Th17/CD25+Foxp3+Treg were gradually up-regulated in patients with mild, moderate, severe, very severe COPD (P<0.05), while the ratio of CD25+Foxp3+Treg/CD4+was gradually down-regulated (P<0.05).Moreover, the ratios of Th17/CD4+and Th17/CD25+Foxp3+Treg in COPD patients were negatively correlated with lung function (P<0.05), while the ratio of CD25+Foxp3+Treg/CD4+was positively correlated with lung function (P<0.05).Conclusions：Th17/CD25+Foxp3+Treg imbalance involves in the progression of COPD, suggesting that Th17/CD25+Foxp3+Treg immunomodulatory therapy may become a new approach for the treatment of COPD.

chronic obstructive pulmonary disease; immunomodulation; Th17 cells; T-lymphocytes

2016-07-01[接受日期]2016-11-29

上海市閔行區自然科學基金(2011MHZ03)，上海市科學技術委員會自然基金生物引導類項目(134119b1200)，上海市衛生系統優秀學科帶頭人資助項目(13B034)，復旦大學青年骨干科研啟動基金(11L-34).Supported by Natural Science Foundation of Minhang District in Shanghai (2011MHZ03), Natural Foundation-Biological Guide Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (134119b1200), Excellent Academic Leaders of Shanghai Health System (13B034) and Foundation of Start-Up Research by Youth Cadre of Fudan University (11L-34).

何燕超，碩士，住院醫師.E-mail: 360699058@qq.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-52880000, E-mail: yanlihong1973@aliyun.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160709

R 563.9

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