多疣壁虎纖維連接蛋白在壁虎脊髓斷尾再生中的表達變化及作用

宋紅花， 王勇軍， 吳尤佳， 孫寶蘭

1.南通大學附屬醫院小兒內科, 南通 226001 2.南通大學神經再生重點實驗室, 南通 226001

論 著

多疣壁虎纖維連接蛋白在壁虎脊髓斷尾再生中的表達變化及作用

宋紅花1， 王勇軍2*， 吳尤佳1， 孫寶蘭1

1.南通大學附屬醫院小兒內科, 南通 226001 2.南通大學神經再生重點實驗室, 南通 226001

目的：通過研究多疣壁虎纖維連接蛋白(fibronectin, FN)在多疣壁虎斷尾再生過程中的表達變化及其對Gsn3增殖、遷移和細胞突起生長的影響，初步探討FN在脊髓再生中的作用及可能機制。方法：應用簡并PCR技術從多疣壁虎組織中獲得FN的一段特異性EST序列。采用實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reation, qRT-PCR)技術檢測壁虎斷尾損傷脊髓中FN mRNA的變化。用體外人源FN蛋白培養壁虎少突膠質細胞系Gsn3細胞，DiI染色觀察FN對Gsn3細胞形態及增殖的影響；Transwell技術檢測FN對Gsn3細胞遷移的影響。結果：在壁虎斷尾損傷后再生脊髓遠側端，FN mRNA表達急劇上調，在斷尾后1 d表達最高，隨著時間延長逐漸下降。在體外，人源FN促進壁虎Gsn3細胞增殖和遷移，但不能使細胞突起伸長。結論：FN可能通過促進少突膠質細胞的增殖和遷移參與壁虎斷尾后脊髓的再生。

纖維連接蛋白；再生；Gsn3細胞；增殖；遷移

高等動物中樞神經損傷后的再生與功能恢復一直是神經科學研究領域的熱點與難點。中樞神經系統損傷后再生失敗是由于不能激活神經元生長能力，且周圍環境中存在生長抑制因子及缺少營養支持[1]。纖維連接蛋白(fibronectin, FN)是一種重要的營養因子，是胞外基質復合物的重要組成成分。FN至少是11種不同整聯蛋白異二聚體的配體，促進細胞的黏附[2]。大量研究表明，FN參與多種組織的損傷和修復。成體高等動物中樞神經系統損傷后不能再生，而低等動物卻具有很強的再生能力，如多疣壁虎脊髓損傷后能夠進行自我修復與再生。胞外基質中的FN是否參與壁虎脊髓的再生過程的相關研究較少。壁虎少突膠質細胞Gsn3由Liu等[3]于2012年首次構建。此后的研究[4-5]發現，壁虎Gsn3參與了壁虎脊髓損傷的再生，如壁虎斷尾再生過程中，糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β) 的下調促進少突膠質細胞突起的生長，從而參與損傷脊髓的再生。

本研究通過建立壁虎脊髓損傷模型，初步探討FN在脊髓再生過程中的表達變化及其對Gsn3細胞的影響，為后續深入研究FN參與神經再生的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 成年多疣壁虎(Gekko japonicus)雌雄各5只，大小均一，體質量為(3.0±0.5) g，體長為(5.7±0.2) cm，由南通大學實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。TRIzol試劑、反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，DMEM/F12、DMEM、FBS購自Gibco公司，人源FN購自Sigma公司、DiI 染色液購自Sigma公司、Transwell 購自BD公司、ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 簡并PCR獲得FN特異性EST序列 用TRIzol試劑提取壁虎組織的總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA第1鏈。根據其他各物種蛋白質的同源性，設計FN的簡并引物：上游引物 5′-CGG CGG GAC AAC ATG aart ggt gyg g-3′，下游引物 5′-CGA TGC CCC TGC CGt arc art arc a-3′。用簡并PCR擴增特異性EST序列。將此序列測序后與NCBI上的其他序列進行比對。

1.2.2 Real-time PCR檢測FN mRNA 在多疣壁虎斷尾再生中的表達變化 以擴增出的EST序列為模板，用Primer 5軟件設計引物。其中上游引物5′-GAC AAG CAG CAC GAC ATG G-3′，下游引物5′-CCC TTC TTC GTG GCG TTT-3′。用TRIzol提取壁虎斷尾0 d、1 d、3 d、1周、2周脊髓下段的總RNA，并反轉錄為cDNA第1鏈。qRT-PCR反應體系如下：SuperMix-UDG with ROX 12.5 μL、上游和下游引物各0.5 μL、模板 1 μL、 ddH2O 10.5 μL。 反應程序如下：93℃ 2 min，93℃ 30 s，62℃ 30 s；共40個循環。以真核生物延伸因子基因1α(eukaryotic elongation factor-1α，EF-1α)為內參基因。

1.2.3 壁虎Gsn3細胞克隆株的培養及FN處理 Gsn3細胞于30℃、5% CO2條件下，在含1% 雙抗、10% FBS的DMEM/F12的培養基中培養。培養2 d 后，細胞融合度達80%，用胰酶消化片刻后重懸，進行傳代擴增。用購買的人源FN以2 μg/cm2鋪皿培養壁虎Gsn3細胞，2 d后用DiI染色，顯微鏡下觀察細胞形態，并隨機選取5個視野，拍照并統計。

1.2.4 Transwell檢測Gsn3細胞遷移情況 制備Gsn3細胞懸液，調整細胞密度至3×105個/mL。取細胞懸液100 μL加入Transwell小室。24孔板下室加入含30 μg/mL FN的完全培養基。細胞常規培養2 d，用無鈣PBS洗2次，甲醇固定30 min后，將小室適當風干。用0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3次。顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察細胞，計數。

2 結 果

2.1 FN在多疣壁虎斷尾脊髓再生過程中的表達變化 將簡并PCR擴增得到的EST序列與NCBI上的其他序列進行比對，結果顯示，此序列與其他物種FN基因的高度同源。以此EST序列為模板設計qRT-PCR引物，對脊髓再生過程中FN的表達進行檢測。結果顯示：以EF-1α基因作為參照，斷尾損傷后，FN mRNA表達上調，斷尾后1 d FN的轉錄水平達最高，然后逐漸下降(P<0.01，圖1)。

2.2 人源FN對壁虎Gsn3細胞增殖的影響 用人源FN蛋白(2 μg/cm2)鋪皿培養Gsn3細胞2 d后，DiI染色結果顯示，FN處理后細胞的數量明顯增多(P<0.05，圖2)。

2.3 人源FN對壁虎Gsn3細胞突起生長的影響 人源FN蛋白(2 μg/cm2)鋪皿培養Gsn3細胞2 d后，DiI染色結果顯示，FN蛋白處理細胞的突起長度與對照組差異比較，無統計學意義(圖3)。

2.4 人源FN對壁虎Gsn3細胞遷移的影響 人源FN蛋白(2 μg/cm2)鋪皿培養Gsn3細胞2 d后甲醛固定，結晶紫染色結果顯示，FN處理細胞的遷移數量較對照組明顯增多(P<0.01，圖4)。

圖2 人源FN對壁虎Gsn3細胞增殖的影響Orignial magnification: ×10.*P<0.05與control組比較; n=3,

圖3 FN對Gsn3細胞突起生長的影響Orignial magnification: ×20.n=3,

圖4 FN對Gsn3細胞遷移的影響Orignial magnification: ×20.**P<0.01與control組比較；n=3,

3 討 論

壁虎是一種再生能力很強的脊椎動物，斷尾后能夠再生出原有的尾部結構，其中包括脊髓的再生。由于壁虎在進化上更加接近高等動物，因此其斷尾損傷模型成為研究高等動物中樞神經再生的良好模型。通過對壁虎斷尾再生機制的研究，能為人類神經系統的損傷修復研究提供線索。多疣壁虎斷尾損傷后，首先是斷尾處愈傷上皮再生，然后是頂端復層上皮帽狀結構(AEC)形成，接著是芽基的形成和尾部延伸。在壁虎脊髓損傷再生過程中，有多種營養因子和信號調節分子參與其中。

FN是一種高分子糖蛋白，廣泛存在于細胞表面、細胞外液、基膜和結締組織，是細胞外基質的重要組成部分。FN參與細胞多種生理功能，包括調節細胞的增殖、分化、遷移和聚集等。FN在機體內的分布和含量與腫瘤的發生、發展有著密切聯系。FN可直接影響腫瘤的生物學行為，如促進癌癥細胞的增殖、侵襲和轉移等[6-7]。FN除在癌癥中發揮重要作用外，還參與機體的創傷修復和再生過程。FN是肌肉源性干細胞的優先附著底物，老年小鼠骨骼肌干細胞龕中FN水平的降低會損害肌肉源性干細胞的功能和骨骼肌的再生能力[8]。中性粒細胞合成的FN對骨折愈合有明顯的促進作用[9]。此外，FN作為細胞外基質成分，參與傷口的愈合與皮膚的再生[10]。本研究發現，斷尾損傷后FN mRNA表達上調，斷尾后第1天達最高，然后逐漸下降，但在脊髓再生過程中持續高表達。這一結果與上述研究中FN參與組織損傷修復的結果相一致。FN在脊髓損傷的第1天表達最高，可能是因為機體受到斷尾損傷后發生應激反應，從而大量分泌FN，促進傷口的愈合和愈傷上皮的形成。愈傷上皮形成以后，后續部分的再生關鍵是神經細胞的修復和再生。大量研究[11-12]表明，FN支持中樞神經系統中神經元突起的萌發與軸突的再生。研究[13]也表明，間充質干細胞分泌的FN在體外誘導神經突起的生長和促進神經纖維的再生。因此，可以初步斷定FN參與了壁虎神經系統的損傷修復。

在神經系統中，少突膠質細胞扮演了重要的角色。少突膠質細胞在髓鞘形成和神經電信號的傳遞過程中起重要作用，同時能維持和保護神經元的正常功能。所以本實驗選擇壁虎少突膠質細胞作為體外研究對象。本研究采用人源FN培養Gsn3細胞的主要原因有3個：第一，由于現階段還沒有商品化的壁虎FN蛋白，其來源受到限制；第二， FN基因及其功能在進化過程中保守性很高，因此可以采用人源FN，若異源性FN對Gsn3細胞有作用，那么可以間接表明同源性FN對Gsn3細胞的作用；第三，我們研究的最終目的是為人類的脊髓損傷再生提供實驗基礎。

綜上所述，本研究中，FN在多疣壁虎斷尾脊髓再生過程中的表達增加；FN體外培養壁虎Gsn3細胞能促進細胞的增殖和遷移。這提示壁虎在脊髓損傷后大量神經細胞死亡的情況下，FN可促進少突膠質細胞遷移到受損部位并大量增殖，參與髓鞘形成和保護受損的神經元。因此認為，少突膠質細胞替代療法是治療脊髓損傷的一個潛在的有效策略。FN在中樞神經系統損傷和修復中的作用及機制還有待進一步深入研究。

[1] SUN F, HE Z.Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS[J].Curr Opin Neurobiol, 2010, 20(4):510-518.

[2] LEISS M, BECKMANN K, GIRS, et al.The role of integrin binding sites in fibronectin matrix assemblyinvivo.[J].Curr Opin Cell Biol, 2008, 20(5):502-507.

[3] LIU M, GU Y, LIU Y, et al.Establishment and characterization of two cell lines derived from primary cultures of Gekko japonicus cerebral cortex[J].Cell Biol Int, 2010, 34(2):153-161.

[4] SONG H, MAN L, WANG Y, et al.The regenerating spinal cord of gecko maintains unaltered expression of β-catenin following tail amputation[J].J Mol Neurosci, 2015, 55(3):653-662.

[5] WANG Y, GU Q, DONG Y, et al.Inhibition of gecko GSK-3β promotes elongation of neurites and oligodendrocyte processes but decreases the proliferation of blastemal cells[J].J Cell Biochem, 2012,113(6):1842-1851.

[6] MOON P G, LEE J E, CHO Y E, et al.Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer[J].Oncotarget, 2016,28,7(26):40189-40199.

[7] SPONZIELLO M, ROSIGNOLO F, CELANO M, et al.Fibronectin-1 expression is increased in aggressive thyroid cancer and favors the migration and invasion of cancer cells[J].Mol Cell Endocrinol, 2016, 431:123-132.

[8] LUKJANENKO L, JUNG M J, HEGDE N, et al.Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice[J].Nat Med, 2016,22(8):897-905.

[9] BASTIAN O W, KOENDERMAN L, ALBLAS J,et al.Neutrophils contribute to fracture healing by synthesizing fibronectin+ extracellular matrix rapidly after injury[J].Clin Immunol, 2016, 164:78-84.

[10] BIELEFELD K A, AMINI-NIK S, WHETSTONE H, et al.Fibronectin and beta-catenin act in a regulatory loop in dermal fibroblasts to modulate cutaneous healing[J].J Biol Chem, 2011, 286(31):27687-27697.

[11] GONZALEZ-PEREZ F, UDINA E, NAVARRO X.Extracellular matrix components in peripheral nerve regeneration[J].Int Rev Neurobiol, 2013, 108:257-275.

[12] TONGE DA, DE BURGH HT, DOCHERTY R, et al.Fibronectin supports neurite outgrowth and axonal regeneration of adult brain neurons in vitro[J].Brian Res, 2012, 1453:8-16.

[13] ZENG X, MA Y H, CHEN Y F, et al.Autocrine fibronectin from differentiating mesenchymal stem cells induces the neurite elongation in vitro and promotes nerve fiber regeneration in transected spinal cord injury[J].J Biomed Mater Res A, 2016, 104(8):1902-1911.

[本文編輯] 姬靜芳

Effect and expression changes of fibronectin on spinal cord regeneration of Gekko japonicus

SONG Hong-hua1, WANG Yong-jun2*, WU You-jia1, SUN Bao-lan1

1.Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China 2.Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China

Objective：To observe expression changes of fibronectin (FN) and its effect on Gsn3 proliferation, migration and oligodendrocyte of spinal cord regeneration of Gekko japonicus, and also analyze the effects and possible mechanism of FN involved in spinal cord regeneration.Methods：Using degenerate PCR to obtain a special EST sequence of FN from Gekko japonicus tissue.The expression changes of FN mRNA in the regenerating spinal cord after tail amputation were detected by real-time quantitative polymerase chain reation (qRT-PCR).In vitro, the human FN was used to culture Gekko oligodendrocyte cell line (Gsn3 cells).The morphology and proliferation of Gsn3 cells after FN treatment were also observed by DiI staining, whereas the migration was detected by Transwell.Results：During the Gekko spinal cord regeneration, FN mRNA expression is significantly increased at 1 dpa (1-day post amputation) then decreased gradually with the time extension in distant spinal cord.FN is able to promote the proliferation and migration of Gsn3 cells, but could not promote the extension of process in vitro.Conclusions：FN participates in spinal cord regeneration by affecting oligodendrocyte proliferation and migration.

fibronectin; regeneration; Gsn3 cells; proliferation; migration

2016-07-22[接受日期]2016-12-14

國家自然科學基金(31471011).Supported by National Natural Science Foudation of China (31471011).

宋紅花，碩士，研究實習員.E-mail: song_hong_hua@126.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0513-85051818, E-mail: wyjbs@ntu.edu.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160751

R 322.8

A