大腸癌肝轉移患者血清中相關癌基因甲基化水平的檢測

齊 翀, 郝 總， 洪 亮， 殷慶章

復旦大學附屬上海市第五人民醫院普通外科，上海 200240

短篇論著

大腸癌肝轉移患者血清中相關癌基因甲基化水平的檢測

齊 翀, 郝 總， 洪 亮， 殷慶章*

復旦大學附屬上海市第五人民醫院普通外科，上海 200240

目的：探討大腸癌肝轉移患者血清相關癌基因甲基化水平的變化。方法：選擇2011年9月—2013年12月因原發性大腸癌入院伴或不伴肝轉移患者各32例，分別作為試驗組A和試驗組B。所有患者在入院之前均未進行化療或放療。另選擇20例健康體檢者作為對照組。提取研究對象血清中DNA，采用甲基化特異性PCR法檢測E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE基因甲基化異常。結果：試驗組A檢測出19例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化異常；試驗組B檢測出10例E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化異常；對照組未檢測出E-cad、ID4、ESR1、APC或HACE甲基化異常。3組間差異有統計學意義(P<0.01)。結論：血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因甲基化狀態聯合檢測有利于大腸癌肝轉移的臨床診治。

大腸癌；肝轉移；甲基化；癌基因

在中國，大腸癌的發病率及死亡率逐年增高。35%～55%的大腸癌患者會發生肝轉移，約25%的患者在診斷時已出現肝轉移[1]。肝轉移是造成大腸癌患者死亡的主要原因之一。目前，臨床常用的大腸癌血清學標志物包括基因和蛋白，但是大多數標志物的特異性和(或)敏感性不理想。近年來發現，腫瘤患者血清中存在DNA質或量改變。在此基礎上發現的腫瘤標志物有良好的臨床應用前景。已有文獻[2-7]報道，E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的異常甲基化狀態與大腸癌的發生、發展及轉移相關，可用來預測大腸腫瘤的復發。本研究進一步分析了大腸癌伴或不伴有肝轉移患者的E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的甲基化情況，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院于2011年9月—2013年12月確診原發性大腸癌伴或不伴有肝轉移患者各32例，分別作為試驗組A和試驗組B。所有患者在入院前均未進行化療或放療。試驗組A 32例患者中，男性13例，女性患者19例；年齡23～78歲，平均(56.5±7.9)歲；Ducks A期11例，B期8例，C期8例，D期5例。試驗組B 32例患者中，男性16例，女性16例；年齡24～79歲，平均(55.5±9.9)歲；Ducks A期12例，B期9例，C期6例，D期5例。另外選擇20例健康體檢者作為對照組，其中男性12例，女性8例；年齡22～75歲，平均(54.5±7.8)歲。3組患者的一般資料差異無統計學意義，具有可比性。本研究通過醫院醫學倫理委員會審核，所有患者知情者同意并簽署知情同意書。

1.2 方 法

1.2.1 3組研究對象的血清收集及DNA提取 術前采集健康體檢者和患者全血2 mL，3 000 ×g離心，收集約1 mL血清，-80℃冰箱保存。采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)，從200 μL血清標本中提取基因組DNA。

1.2.2 DNA甲基化修飾和甲基化特異性PCR 基因組DNA的亞硫酸鹽修飾 吸取約1 μg 的DNA樣品，用3 mol/L NaOH進行變性反應，再行NaHSO3修飾，50℃水浴避光過夜。此時，胞嘧啶可轉變為尿嘧啶或發生甲基化。修飾后的DNA通過乙醇沉淀與PCR級去離子水形成懸浮液，再進行甲基化特異性PCR。甲基化特異性PCR反應體積為25 μL，包括修飾DNA 2 μL、1×PCR buffer Ⅱ (美國Perkin Elmer公司 )、2 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP、上下游引物各1 μmol/L、1 U AmpliTaq Gold polymerase(美國Perkin Elmer公司)。反應條件：95℃變性反應10 min，再95℃ 變性反應30 s，退火45 s，72℃ 退火45 s；共40個循環。體外甲基化DNA(美國Intergen公司)作為陽性對照，不含DNA的蒸餾水作為陰性對照。吸取PCR 產物10 μL，經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙啶(efhidium bromide, EB)染色，紫外光下觀察甲基化特異性引物擴增的條帶情況，并進行標記，未甲基化特異性引物擴增條帶標為未甲基化。實驗重復進行，以確保結果的準確性。

2 結 果

3組研究對象的E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE甲基化檢測結果見表1。試驗組A有19例甲基化異常，陽性率為59.38%；試驗組B有10例甲基化異常，陽性率為31.25%；對照組沒有檢測出甲基化異常。3組差異有統計學意義(P<0.01)。試驗組A中1例患者血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE基因的甲基化異常檢測結果見圖1。

表1 3組研究對象血清E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE甲基化異常檢測結果 n

**P<0.01各組間比較

圖1 試驗組A中1例患者的甲基化檢測結果

3 討 論

大腸癌患者的診斷對及時治療具有重要意義，表觀遺傳學改變如DNA甲基化異常在大腸癌的發生發展中發揮重要作用。既往研究[8]測定了大腸癌患者外周血游離DNA中含表皮生長因子和卵泡抑素結構域的跨膜蛋白 (TPEF)基因啟動子區異常甲基化率，結果提示聯合檢測K-ras、TPEF基因異常可能是一種非損傷性篩選和診斷大腸癌的有效方法。此外，HSP60[9]、TIP30啟動子[10]、CEA、CA19-9和CA242[11]、DLC-1[12]等基因的甲基化情況均有助于診斷大腸癌。

不同基因的甲基化情況也可反映大腸癌肝轉移患者的情況，大腸癌患者和健康人的這些基因的甲基化情況不同。本研究檢測了大腸癌患者血清中E-cad、ID4、ESR1、APC和HACE 基因的甲基化情況，發現32例原發性大腸癌伴肝轉移患者中，19例患者的這5個基因之一甲基化異常，陽性率為59.38%；32例原發性大腸癌不伴有肝轉移患者中，10例患者出現甲基化異常，陽性率為31.25%；而10名健康人沒有出現基因的甲基化異常。這些結果表明，大腸癌伴肝轉移患者甲基化異常的發生率較高，基因甲基化異常參與大腸癌的發生、發展。結合患者的臨床資料，大腸癌相關基因的異常甲基化狀態對大腸癌肝轉移患者的臨床診治有重要意義，而多個基因聯合檢測可以提高診斷的靈敏度和特異性。

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[本文編輯] 姬靜芳

Detection of related oncogenes methylation in serum of colorectal cancer patients with liver metastasis

QI Chong，HAO Zong，HONG Liang，YIN Qing-zhang*

Department of General Surgery, the Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai 200240, China

Objective：To explore the detection results of serum related gene methylation in colorectal cancer patients with liver metastasis.Methods：From hospitalized patients with primary colorectal cancer from September 2011 to December 2013, 32 colorectal cancer patients with liver metastasis and 32 colorectal cancer patients without liver metastasis were selected as the experimental group A (n=30) and experimental group B (n=30), respectively.All patients did not undergo chemotherapy or radiotherapy before admission.In addition, 20 healthy subjects were recruited as the control group.DNA was extracted from serum, and E-cad, ID4, ESR1, APC, and HACE gene methylation were detected by methylation specific PCR method.Results：19 cases with E-cad, ID4, ESR1, APC or HACE abnormal methylation were detected in the experimental group A, 10 cases were detected in the experimental group B, no case was detected in the control group.There were significant differences among the three groups (P<0.01).Conclusions：Detection of serum E-cad, ID4, ESR1, APC, HACE gene methylation status is of great significance for clinical diagnosis and treatment of colorectal cancer liver metastasis.

colorectal cancer; liver metastasis; methylation; oncogene

2016-01-04[接受日期]2016-04-28

上海市衛生局基金(20114268).Supported by Foundation of Shanghai Health Bureau(20114268).

齊 翀，碩士，主治醫師.E-mail: qichong8836@hotmail.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64308151-8528, E-mail: williamyin@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160009

R 735.3+4

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