多發性硬化患者外周血S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達水平的變化

劉大進, 吳明鳳, 余 浩, 張振中, 馬 麗, 姚瑞芹

徐州醫科大學神經生物學研究中心，徐州 221004

短篇論著

多發性硬化患者外周血S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達水平的變化

劉大進, 吳明鳳, 余 浩, 張振中, 馬 麗, 姚瑞芹*

徐州醫科大學神經生物學研究中心，徐州 221004

目的：探討多發性硬化(multiple sclerosis, MS)患者外周靜脈血血清鈣結合蛋白復合物(S100A8/A9)、Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)和基質金屬酶蛋白2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)表達水平的變化。方法：選取MS患者16例作為MS組，健康體檢者16例作為對照組。采用蛋白芯片檢測法對血清樣本進行檢測，定量分析血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達水平的變化。結果：MS組血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平均高于對照組(P<0.01)；MS組患者血清中上述3個指標具有明顯相關性(P<0.05)。結論：MS患者血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2表達上調，聯合檢測三者可能有助于臨床MS疾病活動狀態的判斷。

多發性硬化；S100A8/A9；TLR4；MMP-2

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(central nervous system, CNS)脫髓鞘性疾病，其發病與多種因素有關，其中自身免疫性炎癥反應在MS的發生發展中發揮著重要作用。研究表明，鈣結合蛋白復合物(S100A8/A9)參與了神經系統炎癥反應的起始過程[1]，并且在多種急慢性炎癥性疾病[2]和腫瘤疾病[3]中發揮重要作用。S100A8/A9不僅可作為Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)的內源性配體與其結合，促進IL-17的表達并激活CD8+T細胞，從而誘發自身免疫反應[4]，而且可以通過激活基質金屬酶蛋白2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)介導組織損傷[5]。TLR4的激活可以直接通過NF-κB信號通路促進其下游靶蛋白MMP-2的表達和激活[6-7]，發揮生物學功能。因此，上述三者功能上的緊密聯系與多種疾病的發生發展密切相關。MS作為典型的神經系統免疫性損傷疾病，其發病過程中上述3個指標可能呈現規律性改變，但目前鮮見關于S100A8/A9、TLR4和MMP-2在MS病程中的變化報道。因此，本研究檢測了上述指標在MS患者血清中的表達變化，旨在探討三者與MS的關系，為MS的臨床診斷、治療及預后提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2015年6月在徐州醫科大學附屬醫院住院的MS確診患者16例為MS組，其中男性4例，女性12例；年齡25～50歲，平均(40.13±9.00)歲。全部MS患者均符合2010年McDonald診斷標準[8]。排除標準：入院前3個月內接受免疫調節治療的患者；合并其他免疫相關疾病，如系統性紅斑狼瘡、糖尿病、腫瘤等患者；合并顱內外感染，如腦炎、腦膜炎等患者；腦卒中患者。

對照組為本院健康體檢者16例，其中男性4例，女性12例；年齡25～48歲，平均(38.88±6.92)歲，無心肝腎等器質性疾病史，采血前1周無服藥史，自愿參與研究。兩組人群年齡、性別構成、病程和受教育年限差異無統計學意義(表1)，具有可比性。

組別n年齡(歲)性別(男/女)病程(年)受教育年限(年)MS組1640．13±9．004/125．75±2．3210．13±2．64對照組1638．88±6．924/12-10．50±3．67P值1．0000．6351．000-0．872

1.2 檢測方法 采用RayBio○RG-系列玻片式人細胞因子抗體芯片(蛋白芯片)對血清樣本進行檢測，并通過激光掃描儀檢測熒光信號，定量分析血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平。所有患者均簽署知情同意書后，MS組于上午采血，正常對照組于清晨空腹抽血，采肘靜脈血5 mL，立即1 500×g離心5 min，取上清分裝于分離管內，標記，-80℃凍存待測。蛋白芯片檢測由廣州瑞博奧生物科技有限公司完成。

2 結 果

各組患者血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平熒光定量分析結果顯示，MS組血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平均高于對照組(圖1)。

圖1 2組患者血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平的比較**P<0.01, ***P<0.001與對照組相比

MS組患者血清S100A8/A9、TLR4及MMP-2相關性分析顯示，在去除個別離群值后，3者之間兩兩相關性良好，相關系數有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 MS組血清S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平相關性分析散點圖

3 討 論

MS的發病機制復雜，臨床表現多樣，目前對于MS疾病的診斷主要是依據臨床表現結合腦脊液、神經電生理學和影像學檢查。血清學檢查在目前的臨床診斷中應用極少。本實驗通過檢測患者血清中S100A8/A9、TLR4和MMP-2水平變化發現，三者在MS患者血清中的含量比正常對照組明顯升高，提示血清學相關細胞因子檢測在臨床MS患者診斷中可能也具有一定的輔助價值。對于傳統的診斷標準難以評價和確診的MS，應用血清學檢查有望成為重要的診斷依據，實現早期診斷和及時治療。

自身免疫性炎癥反應在MS的發生發展中扮演重要角色。免疫系統的活化與炎癥因子的釋放是介導自身免疫病的基礎。S100鈣調素蛋白家族中的重要成員S100A8和S100A9構成的異源二聚體S100A8/A9參與炎癥反應，與機體自身免疫病關系密切。其主要存在于炎性細胞的胞質中或胞膜上，在炎癥狀態下，炎性細胞活化后被釋放入血漿及體液，因而被認為是一種潛在的臨床炎癥標記物。S100A8/A9已被證實在多種炎癥狀態下高表達，如巨細胞性動脈炎、囊性纖維病、類風濕性關節炎、惡性腫瘤及自身免疫性疾病[9-10]。但其在臨床MS病程中的具體變化目前未見報道。多數學者認為，在自身免疫病患者疾病發作前，尚無任何其他臨床標記可提示時，S100A8/A9已開始升高。本研究中MS組患者血清S100A8/A9水平較正常對照組顯著升高，S100A8/A9在MS組血清中含量遠遠高于對照組(約10倍)，進一步證實了上述觀點。且van Bon等[11]通過蛋白質組學檢測發現，在另一種自身免疫性疾病系統性硬化患者的血清中，S100A8/A9水平明顯上調。提示S100A8/A9對于自身免疫性疾病如MS的診斷和治療具有一定的意義。

TLR4是天然免疫系統識別病原微生物的主要受體，通過與微生物病原相關分子模式相結合，啟動信號轉導通路，在人體天然免疫及獲得性免疫中起重要作用。TLR4分布廣泛，在中樞神經系統多種細胞中均有表達，如小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞等[12]。小膠質細胞是中樞神經系統TLR4炎性反應的主要細胞類型，較易被激活誘導。TLR4主要表達在小膠質細胞。在MS患者中樞神經系統病變周圍除有T淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞浸潤外，還有大量活化的小膠質細胞和星形膠質細胞，這提示TLR4參與介導了神經元損傷[13]。Olson等[14]報道，TLR4在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型小鼠的中樞神經系統表達水平在整個疾病過程中始終呈持續升高狀態。而抑制TLR4信號轉導途徑[15]對EAE發生具有一定抑制作用[16]。本研究結果顯示，MS組患者血清樣本中TLR4含量明顯高于對照組，具有統計學意義，提示TLR4在人類MS疾病進程中與EAE動物模型中發揮相似的作用，促進MS發病。

MMPs是一類能特異性降解細胞外基質的蛋白水解酶家族，與炎癥、感染及自身免疫疾病密切相關。MMP-2作為該家族最主要成員之一，在炎癥細胞和腫瘤細胞的遷移和浸潤中被廣泛研究[7]。MMP-2在CNS疾病血腦屏障的破壞中發揮重要的作用[17]。研究[18]表明，在EAE大鼠模型中，MMP-2在疾病早期即出現表達上調，當MMP-2分泌過量時可以降解血管的基底膜，引起血腦屏障開放，促進炎性細胞向CNS浸潤最終導致軸突損傷。向EAE大鼠大腦內注射MMP-2可以導致細胞外基質的破壞和血腦屏障的開放，加速EAE的發病[19]。而在EAE模型中應用具有抑制MMPs活性的二甲胺四環素(minocycline)可以減輕動物的發病程度[17]。本研究結果顯示，在MS患者血清樣本中MMP-2的含量顯著高于正常對照組，這與之前的報道結果一致。說明對MMP-2進行干預可能在MS的診斷和治療中具有一定的應用價值。

綜上，S100A8/A9、TLR4和MMP-2在自身免疫性疾病的發生發展中發揮著廣泛的作用。三者既可能是獨立作用于機體引起疾病，也可能是通過某種內在聯系共同作用于機體導致發病。從相關性分析結果來看，三者在MS患者血清中的表達水平存在明顯的相關性，因此，我們推測S100A8/A9、TLR4和MMP-2在MS疾病的發展中很可能是相互作用、相互關聯的。三者在MS病程中的可能作用機制為：(1)活化的炎癥細胞釋放S100A8/A9異二聚體至細胞外，與TLR4結合后經過MyD88依賴通路或MyD88非依賴通路激活NF-κB和p38 MAPK信號通道促進炎癥因子的合成與釋放，并放大炎癥因子反應，誘導MS發病。(2)S100A8/A9通過結合TLR4促進MMP-2的表達，介導血腦屏障的破壞，促進炎性細胞和炎癥介質向CNS浸潤，加速MS發病。(3)S100A8/A9直接激活或通過TLR4介導的NF-κB通路激活MMP-2，直接介導軸索損傷。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Changes of serum S100A8/A9, TLR4, and MMP-2 levels in multiple sclerosis patients

LIU Da-jin, WU Ming-feng, YU Hao, ZHANG Zhen-zhong, MA Li, YAO Rui-qin*

Research Center of Neurobiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu, China

Objective：To investigate the clinical significance of S100A8/A9, Toll-like receptor 4 (TLR4) and matrix metalloproteinase (MMP-2) levels in peripheral venous serum of patients with multiple sclerosis (MS).Methods：Totally 16 cases of MS patients were selected as MS group, and 16 cases of healthy people as control group.The serum samples were detected by protein chip detection method to quantificationally analyze the changes of serum S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 levels.Results：The serum of S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 levels in MS group were significantly higher than which in control group (P<0.01); The three indicators in MS patients showed significant correlations (P<0.05).Conclusions：The expression of S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 in the serum of patients with clinical MS is up-regulated, suggesting that they might be involved in the pathogenesis of MS.Combined detection of serum S100A8/A9, TLR4 and MMP-2 levels may provide a new way of thinking for the diagnosis, treatment and judgment of state in clinical MS.

multiple sclerosis; S100A8/A9; TLR4; MMP-2

2016-08-21[接受日期]2016-09-05

國家自然科學基金(81271345)，江蘇省自然科學基金(BK20131132)，江蘇省2014年度高校“青藍工程”中青年學術帶頭人資助項目，江蘇省高校自然科學研究面上項目(15KJB180018，15KJB310023).Supported by National Natural Science Foundation of China (81271345), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20131132), and 2014 "Qing Lan Project" Young Academic Leaders Foundation Project in Colleges and Universities of Jiangsu Province, Surface Project of University Natural Science Research of Jiangsu Province(15KJB180018,15KJB310023).

劉大進，碩士生.E-mail: LDJ_XZMU@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0516-83262301, E-mail: wenxi_yao@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160830

R 744.5+1

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