安徽漢族人群血小板膜糖蛋白Ⅱb基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

張 志， 劉 萍

1.安徽省第二人民醫(yī)院內(nèi)六科，合肥 200041 2.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，合肥 230061

研究簡(jiǎn)報(bào)

安徽漢族人群血小板膜糖蛋白Ⅱb基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

張 志1， 劉 萍2

1.安徽省第二人民醫(yī)院內(nèi)六科，合肥 200041 2.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，合肥 230061

冠心病；基因多態(tài)性；血小板膜糖蛋白；糖蛋白Ⅱb

近年來，我國(guó)冠心病(coronary heart disease，CHD)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的健康。血栓形成易導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈閉塞，引起心肌梗死、心絞痛，是CHD患者病情加重的主要始發(fā)因素[1]。血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP) 覆蓋在血小板質(zhì)膜表面，在血小板活化和血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。目前已發(fā)現(xiàn)GP的5種血小板膜受體；GP與受體在一定條件下形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)血小板性血栓的形成，其中GPⅡb HPA-3基因具有重要作用[4]。HPA-3基因長(zhǎng)17.2 kb，含30個(gè)外顯子，編碼1 039個(gè)氨基酸，其中第26外顯子上存在I843S多態(tài)性，形成HPA-3血型[5]。因此，本研究對(duì)安徽漢族人群GPⅡb HPA-3基因多態(tài)性進(jìn)行研究，探討其與冠心病發(fā)生的相關(guān)性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2011年12月在安徽省立醫(yī)院和安徽省第二人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的CHD患者74例，其中男性39例，女性35例。CHD診斷符合世界衛(wèi)生組織(WHO)AHA/WH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。患者年齡41～86歲，平均(64.8±12.2)歲。另選健康對(duì)照組60例，為安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院和安徽省第二人民醫(yī)院門診健康體檢者，其中男性38例，女性22例，年齡42～82歲，平均(60.2±9.8)歲。兩組人群年齡構(gòu)成、性別比例、吸煙量及血脂水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血小板膜GP基因檢測(cè)及測(cè)序鑒定 取研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，用全血基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增外周血基因組DNA，引物序列如下:上游引物5′-CTC AAG GTA AGA GCT GGG TGG AAG AAA GAC-3′，下游引物5′-CTC ACT ACG AGA ACG GGA TCC TGA AGC CTC -3′。擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為253 bp，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系如下：在EP管中加入試劑，使終末濃度分別為1×buffer，MgCl22.8 mmol/L、dNTP 200 μmol/L、基因組DNA 400 ng、Taq酶2 U、引物0.25 pmol/μL，總體積為50 μL。

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序如下：在96 ℃下進(jìn)行預(yù)變性，時(shí)間維持在5 min，然后在96 ℃下進(jìn)行變性，時(shí)間為90 s，變性過后在60.5 ℃進(jìn)行退火處理，時(shí)間90 s，在72 ℃下延伸(持續(xù)180 s)，然后72 ℃ 40 個(gè)循環(huán)，7 min。用1×TBE緩沖液進(jìn)行電泳，在100 V下電泳約30 min，待點(diǎn)樣液在凝膠上行進(jìn)至2/3處時(shí)停止電泳。在紫外透射儀下觀察結(jié)果，通過PCR產(chǎn)物的條帶與DNA Marker的對(duì)比，分析PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。病例組及對(duì)照組共134例標(biāo)本全部進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行凝膠電泳，條帶均清晰說明PCR擴(kuò)增成功。將PCR產(chǎn)物送上海生物科技有限公司測(cè)序，分析是否存在GPⅡb HPA-3基因多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者GPⅡb HPA-3基因型分析 PCR擴(kuò)增后GPⅡb HPA-3的基因產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察到產(chǎn)物為253 bp的片段，符合預(yù)期大小。測(cè)序結(jié)果(圖1)顯示：在GPⅡb HPA-3基因T18809G發(fā)生變異，導(dǎo)致絲氨酸取代異亮氨酸，造成I843S(Ile843Ser)多態(tài)性。

圖1 GPⅡb基因測(cè)序結(jié)果

A: GPⅡb HPA-3的第843位點(diǎn)的堿基是T; B: GPⅡb HPA-3的第843位點(diǎn)的堿基是G; C: GPⅡb HPA-3的第843位點(diǎn)的堿基是T/G

2.2 兩組人群等位基因的分布頻次分析 74例冠心病患者中，GPⅡb HPA-3形成了3種基因型：HPA-3aa、HPA-3ab、HPA-3bb。病例組a等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為80，b等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為68；對(duì)照組a等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為86，b等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)為34。與對(duì)照組相比，病例組aa和ab基因型分布明顯增多，a等位基因出現(xiàn)的頻率也較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 兩組患者GPⅡb HPA-3的基因多態(tài)性分析

3 討 論

GPⅡb/Ⅲa作為細(xì)胞表面黏附蛋白受體超基因家族中的成員，在血栓形成中發(fā)揮重要作用，這種受體在抑制血小板聚集方面發(fā)揮一定作用，是目前研究的熱點(diǎn)。但是，目前關(guān)于CHD與GPⅡb基因相關(guān)性的研究較少，且研究結(jié)果不盡相同[6-8]。因此，本研究針對(duì)與我國(guó)漢族人群關(guān)聯(lián)最大的HPA-3基因進(jìn)行分析，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn),CHD人群GPⅡb等位基因攜帶者頻數(shù)較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示：冠心病的發(fā)生與GPⅡb基因多態(tài)性存在著一定的相關(guān)性。這種基因多態(tài)性可能是CHD患者的遺傳易感因子。由于本研究樣本量較小，相關(guān)研究結(jié)論仍需進(jìn)一步的大樣本研究證實(shí)。

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[本文編輯] 葉 婷， 曉 璐

Correlation study of platelet glycoproteinⅡb gene polymorphism and coronary heart disease in Anhui Han population

ZHANG Zhi1, LIU Ping2

1.Department of Internal Medicine Ⅵ, Anhui No.2 Province People’s Hospital, Hefei 200041, Anhui, China 2.School of Clinical Medicine, Anhui Medical College, Hefei 230061, Anhui, China

coronary heart disease; gene polymorphism; platelet membrane glycoprotein; glycoproteinⅡb

2016-03-31[接受日期]2016-10-20

安徽省教育廳科研項(xiàng)目 (KJ2009B188Z).Supported by Research Project of Provincial Education Board of Anhui (KJ2009B188Z).

張 志，主治醫(yī)師.E-mail:583763687@qq.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160390

R 541.4

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