水飛薊素逆轉人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM耐藥性實驗研究

陸一丹 徐良額 裘嘉琪 毛丹漪 劉曉谷 王大維

水飛薊素逆轉人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM耐藥性實驗研究

陸一丹 徐良額 裘嘉琪 毛丹漪 劉曉谷 王大維

目的觀察水飛薊素（Silymarin，Sily）對人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM的逆轉耐藥作用。方法以CCK－8法測定阿霉素（Adm）對人乳腺癌敏感細胞株MCF－7/S和耐藥細胞株MCF－7/ ADM的毒性作用，計算出耐藥倍數。以無細胞毒性的Sily（10μg/mL）作為逆轉耐藥劑，聯合Adm觀察其對耐藥細胞株MCF－7/ADM的逆轉耐藥作用，計算得逆轉倍數。結果（1）Adm對MCF－7/S和MCF－7/ADM的半數抑制濃度（IC50）分別為1．773μg/mL和43．812μg/mL，耐藥倍數為24．7倍。（2）Sily能夠增強ADM對MCF－7/ADM的細胞毒作用。以10μg/mL（抑制率為2．0%）的Sily聯合Adm作用于MCF－7/ADM 48h后，耐藥細胞株的IC50降至7．798μg/mL，逆轉倍數為5．6倍（P＜0．01）。結論Sily能夠逆轉人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM的耐藥性。

乳腺癌；耐藥細胞株；水飛薊素；逆轉耐藥

乳腺癌是實體瘤中應用化療最有效的腫瘤之一，但由于多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現象的產生而導致化療失敗，并易引起的復發和轉移，降低了許多抗癌藥如阿霉素（adriamycin，Adm）的臨床療效。克服MDR的方法之一是使用逆轉劑，由于逆轉劑的人體生物利用度差或不良反應嚴重，導致逆轉劑在臨床舉步維艱[1]，尋找高效低毒的耐藥逆轉劑是當前乳腺癌治療的研究熱點。本實驗從天然植物中選擇水飛薊素（Silymarin，Sily）開展對Adm耐藥性的研究。

1 材 料

1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株MCF－7/S購自中科院上海細胞庫，具有多藥耐藥表型的耐阿霉素細胞株MCF－7/ADM由浙江大學醫學院附屬第二醫院腫瘤研究所提供。

1.2 藥物及試劑 Adm（浙江海正藥業股份有限公司，批號H33021980）；Sily（80%）干粉（西安小草植物科技有限責任公司，批號XC20140423）。Adm用注射用葡萄糖水配成10mg/mL的工作母液，Sily干粉先用DMSO溶解為500mg/mL的工作母液（DMSO在無毒劑量內），分裝后避光保存于－20℃冰箱，使用時用培養液配成相應濃度應用液。CCK－8（碧云天生物技術研究所，批號0703081421）。

2 方法

2.1 細胞培養 將敏感細胞株MCF－7/S置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中，在37℃、飽和濕度及5%CO2的細胞培養箱內傳代培養。相應耐藥株MCF－7/ADM連續培養在含1．0μg/mL的Adm的上述培養液中，培養條件相同。

2.2 MCF－7/ADM耐藥細胞株對Adm耐藥倍數的測定 實驗分MCF－7/S+Adm、MCF－7/ADM+Adm組、空白組（只含培養液）、陰性對照組四組。取對數生長的MCF－7/S、MCF－7/ADM細胞懸液100μL分別接種于96孔培養板中，每孔細胞數均為2×105個，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育12h后加入不同濃度的Adm溶液（用FBS（－）RM1640培養液將10mg/mL的工作母液配成相應濃度應用液），敏感組Adm終濃度分別為0．16、0．8、4、20μg/mL和耐藥組ADM終濃度分別為1、7、50、100μg/mL。同時設立只含RM1640培養液的空白對照和不加任何藥物的陰性對照組，每組均設3個復孔，置于37℃，5%CO2培養箱中孵育48h后棄去上清液，PBS清洗兩遍，加入含10%CCK－8的RM1640培養液100μL/孔，作用3h后用酶標儀檢測波長450nm時的OD值（吸光度）。計算Adm對敏感細胞、耐藥細胞的半數抑制量IC50和耐藥細胞對Adm的耐藥倍數（耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50）。實驗平行重復6次。

2.3 測定無細胞毒性劑量的Sily對MCF－7/ADM耐藥細胞的逆轉作用 實驗分MCF－7/ADM+Adm、MCF－7/ADM+Adm+Sily、MCF－7/ADM+Sily三組。Sily劑量參考文獻，定為10μg/mL[2]，每個濃度設3個復孔；空白和陰性對照組及余法同2．2．1。計算Adm對MCF－7/ADM細胞的IC50，與Sily的逆轉倍數（逆轉前IC50/逆轉后IC50）。實驗平行重復6次。

3 結 果

3.1 Adm對MCF－7/S，MCF－7/ADM的細胞毒性Adm對人乳腺癌MCF－7細胞系的細胞毒性作用與濃度呈正相關，但對敏感株和耐藥株的效價差異巨大，如Adm在0．8μg/mL以上時就對MCF－7/S具有明顯的細胞毒性作用（抑制率28．24%），而到50μg/ mL時對MCF－7/ADM的誘導凋亡作用仍較前者弱（抑制率14．69%）。見表1～2。MCF－7/ADM對Adm的抗腫瘤作用有明顯的耐受性，耐藥倍數（resistance index，RI）為24．7倍，見表4。

表1 Adm對MCF－7/S生長的影響（±s）

表1 Adm對MCF－7/S生長的影響（±s）

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表2 Adm對MCF－7/ADM生長的影響（±s）

表2 Adm對MCF－7/ADM生長的影響（±s）

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3.2Sily對MCF－7/ADM耐藥細胞的逆轉作用 MCF－7/ADM+Sily（10μg/mL）組結果是抑制率僅為2．0%，Sily10μg/mL對MCF－7/ADM為無細胞毒性劑量，排除了藥物協同作用的干擾。Adm對MCF－7/ADM的細胞毒性作用因MDR被削弱，與Sily聯合用藥后，Adm的效價顯著提高，見表3。IC50下降至7．798μg/ mL。Sily增強了Adm對MCF－7/ADM細胞的殺傷作用，提高細胞對Adm的敏感性，逆轉耐藥倍數（reversalfold，RF）為5．6倍，見表4。

表3 Sily對Adm抑制MCF－7/ADM生長的影響（±s）

表3 Sily對Adm抑制MCF－7/ADM生長的影響（±s）

表4 Sily逆轉MCF－7對Adm耐藥的結果（±s）

表4 Sily逆轉MCF－7對Adm耐藥的結果（±s）

注：與MCF7/S組比較，△△P＜0．01；與MCF－7/ADM組比較，**P＜0．01

4 討 論

水飛薊素是從菊科藥用植物水飛薊Silybum marianum L．Gaertn.種子的種皮中提取出來的一種黃酮木脂素類化合物，主要成分有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等黃酮類物質。研究[2－4]表明它具有促進膽汁分泌和消炎、保護肝臟、強抗氧化等作用。近年來，進一步研究發現Sily對膀胱癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌等均具有良好的抑制作用，其抗癌機制呈現多步驟、多靶點、全方位特點，并能增強動物機體細胞免疫功能，適合用于臨床抗腫瘤藥物研發。如Sily Sadava等[5]近期在人小細胞肺癌作用的研究中發現水飛薊賓對人小細胞肺癌細胞株H69和耐藥細胞株VPA17有近似的細胞毒性，IC50在60μM左右，沒有耐藥性，主要引起細胞G1期生長抑制，不影響細胞周期參數，通過激活caspase3的方式啟動凋亡程序，誘導細胞凋亡；劉志剛等[6]研究發現，水飛薊素可誘導人膀胱癌細胞 TCC、T－24的表達，使CDK2、CDK4和相關激酶的活性降低，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞增殖；此外，水飛薊素還能誘導腫瘤細胞分化、抑制腫瘤血管生成、抑制TNF所誘導的NF－kB激活等[7]；韓月恒等[1]經體外細胞實驗發現水飛薊素對乳腺癌MCF－7細胞有一定的抑制作用（IC50＜0．2%）；Rastegar等[8]在人乳腺癌MCF－7細胞系實驗中，發現75μg Sily和Adm有協同效應，能夠增強Adm的治療效果，因此，Sily在較高劑量時能夠抑制腫瘤細胞的增殖、影響其細胞周期的分布或誘導腫瘤細胞的凋亡，并對乳腺癌細胞有一定的抑制作用。

盡管如此，關于Sily對乳腺癌化療逆轉耐藥性的研究鮮有報道，經本實驗證實，Adm作用于MCF－7/ S、MCF－7/ADM時用量相差懸殊，說明體外培養的細胞狀態下乳腺癌細胞的確存在對Adm耐藥的情況；Sily能夠逆轉人乳腺癌耐藥細胞MCF－7/ADM對Adm的耐藥性，水飛薊素與Adm聯合用藥后，增強Adm對乳腺癌耐藥細胞株的殺傷作用，提高耐藥細胞株對Adm的敏感性，相比其他文獻記載中常用的一些逆轉耐藥中藥制劑，如大黃素耐藥逆轉倍數為2．86[9]，粉防己堿為2．0[10]，西藥中10μmol/L環孢素A 和1μmol/L雷帕霉素耐藥逆轉倍數均為1．6[11]，與本研究水飛薊素的逆轉耐藥倍數5．7相差懸殊。可見水飛薊素具有高效的逆轉耐藥作用。

此外，我們選用Sily 10μg/mL（抑制率2%）作為逆轉耐藥實驗的研究劑量，結合文獻記載粉防己堿在不產生細胞毒性時用藥濃度一般在（抑制率≤5%）0．625μg/mL[10]，延胡索乙素則為2．5μg/mL[12]，遠低于中藥水飛薊素。說明在不產生細胞毒性條件下，中藥水飛薊素用藥濃度大于其他逆轉耐藥劑濃度，具有低毒的特點。Sily主要成分為有強抗氧化性的類黃酮，Soria等[13]通過研究Sily在砷（As）對乳腺癌細胞系MCF－7和ZR－75－1的抗癌作用發現，其能減少As對正常細胞的毒性作用而不干擾其抗腫瘤作用，建議Sily作為膳食抗氧化劑輔助癌癥化療。

綜上，中藥水飛薊素不僅具有逆轉乳腺癌耐藥性，而且具有目前臨床藥物所缺乏的高效、低毒優勢，有很大的研究價值。

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（收稿：2015－10－13 修回：2015－10－23）

Reversal Effect of Silymarin on Drug Resistant Breast CancerCell MCF-7/ADM

LU Yidan,XU Liange,QIUJiaqi,MAO Danyi,LIU Xiaogu,WANG Dawei．Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China

ObjectiveTo investigate the effect of silymarin on drug resistance of breast cancer cell line MCF－7/ADM．MethodsThe toxicant effect of adriamycin to MCF－7/S（sensitive strain）and MCF－7/ADM（drug－resistant strain）was measured by CCK－8 in vitrofor resistant index．Silymarin was screened in advance and the dose of 10 μg/ml was nontoxicant to MCF－7/ADM,then MCF－7/ADM was treated with this dose of silymarin（10μg/ml）to observe the reversal effect of silymarin．ResultsIC50 of adriamycin to MCF－7/S and MCF－7/ADM were 1．773 μg/ ml and 43．812μg/ml,respectively．Drug－resistant index of MCF－7/ADM was 24．7．Silymarin increased cell toxic effect of adriamycin．After treated with 10μg/mlsilymarin（inhibition rate was 2．0%）combining with adriamycin for 48h,IC50of adriamycine declined to 7．798μg/ml,and the reversal index was 5．6（P＜0．01）．ConclusionSilymarin could partly reverse drug－resistance of MCF－7/ADMto adriamycinein vitro．

breast carcinoma;drug resistance;silymarin;reversingdrug－resistance

浙江省大學生科技創新活動計劃（新苗人才計劃）項目（No．2014R410038）；浙江省中醫藥科技計劃項目（No．2016ZB030）

浙江中醫藥大學（杭州 310053）

毛丹漪，Tel：18957130865；E－mail:danyimao@163．com劉曉谷，Tel：18858133126；E－mail：liuxiaogu@126．com