芩紅奶牛乳房灌注液提取工藝研究

孫宏冉，楊海明，陳志強，尚靜雪

(內蒙古華天制藥有限公司，內蒙古赤峰市，024070)

芩紅奶牛乳房灌注液提取工藝研究

孫宏冉，楊海明，陳志強*，尚靜雪

(內蒙古華天制藥有限公司，內蒙古赤峰市，024070)

為了確定芩紅奶牛乳房灌注液的最佳提取工藝，通過設計正交試驗，篩選較適宜的溶媒、加水量、提取溫度、提取時間、提取次數等。確定了芩紅奶牛乳房灌注液的最佳提取工藝，為芩紅奶牛乳房灌注液的生產和臨床應用奠定基礎。

芩紅奶牛乳房灌注液；提取工藝；正交試驗

隨著社會經濟水平的發展，人民對生活質量的追求越來越高，對食品安全也更加關注。因此，乳業生產中對乳品質量控制更加嚴格，特別是抗生素殘留是乳品檢驗的內容之一[1]。奶牛乳房炎是危害奶牛養殖業最大的疾病之一，對養殖經濟造成巨大損失。治療奶牛乳房炎經常使用的是抗生素類藥物，雖見效較快，但大量及頻繁使用抗生素造成藥物殘留，影響乳品的質量，并誘導耐藥菌的產生[2]。因此，亟待尋求健康、綠色和無藥物殘留的奶牛乳房炎治療方法。中藥含有多種具有抗炎免疫等生物活性的藥物，且毒副作用較小、殘留少、并具有良好的免疫調節作用，被廣泛應用于奶牛乳房炎防治[3]。

根據中獸醫理論，奶牛乳房炎主要有乳房紅、腫、熱、痛等證候，可采用清熱解毒、通經活血、活絡通乳等治療原則[4]，可采用清熱解毒藥和活血通經類藥物，用輔助藥物以補益、理氣，以扶正祛邪、補氣升陽，以達到治療奶牛乳房炎的目的[5]。本研究依據中獸醫辨證論治理論，參照中獸醫經典方劑，擬定以黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)和紅花(CarthamustinctoriusL.)為君藥，金銀花(LonicerajaponicaThunb.)和蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)為臣藥的中藥復方。

灌注劑是乳房內藥物注射方劑，直接給藥起效更快，而且減少全身毒副作用，所以，灌注劑是比較理想的治療奶牛乳房炎的劑型[6]。中藥提取是中藥制劑的關鍵環節，影響著最終藥物制劑的質量和成本，以及中藥制藥業的現代化水平[7]。本研究擬采用正交試驗設計和單因素試驗結合的方法，結合高效液相色譜檢測技術，選擇較適宜的溶媒、加水量、提取溫度、提取時間、提取次數等，確定芩紅奶牛乳房灌注液的最佳提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 中藥材 黃芩(批號為WT20150268，規格為50kg/袋)；紅花(批號為WT20150264，規格為50kg/袋)；金銀花(批號為WT20150263，規格為50kg/袋)；蒲公英(批號為WT20150281，規格為50kg/袋)。以上藥材均由甘肅蒙吉藥業科技有限責任公司提供。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈，國藥集團化學試劑有限公司生產；冰醋酸、NaOH、無水乙醇，天津市恒興化學試劑制造有限公司生產；磷酸，沈陽市華東試劑廠生產。

1.1.3 對照品 黃芩苷對照品(批號為27HQ-2MM4，規格為20 mg，93.3%)、羥基紅花黃色素A對照品(批號為B8VC-RY8L，規格為20 mg，96.5%)、咖啡酸對照品(批號為X5CL-9XL1，規格為40 mg，97.3%)，中國食品藥品檢定研究院提供；綠原酸對照品(批號為Z0261407，規格為20 mg，97.3%)，由中國獸醫藥品監察所提供。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(型號為LC-2010CHT)，日本島津公司生產；色譜柱(型號為4.6 mm×150 mm，5 μ)，日本島津公司生產；集熱式磁力加熱攪拌器(型號為DF-101S)，金壇市瑞華儀器有限公司生產；旋轉蒸發儀(型號為RE52-99)，循環水式真空泵(型號為SHZ-Ⅲ)，上海亞榮生化儀器廠生產。

2 方法

2.1 提取工藝

2.1.1 黃芩 根據黃芩苷的性質，選擇水作為提取溶媒，設計L8(27)正交試驗，優選黃芩藥材的提取工藝?？疾煲蛩赜刑崛〖铀?A)、提取次數(B)、提取時間(C)、溶解沉淀加水量(D)、調堿pH(E)和保溫時間(F)，以黃芩苷得率為評價指標，因素水平如表1。

表1 黃芩提取工藝因素水平表

2.1.2 紅花 溶媒的選擇取紅花3組各15 g，分別加入225 mL水、225 mL 30%乙醇和225 mL 50%乙醇，分別98℃提取2次，每次1.5 h，藥液分別減壓濃縮至50 mL，高效液相色譜法測定紅花黃色素含量確定合適溶媒。

提取工藝的選擇根據試驗前單因素試驗考察的結果，設計L9(34)正交試驗，優選紅花藥材的提取工藝。考察因素有提取加水量(A)、提取溫度(B)、提取次數(C)、每次提取時間(D)，每個因素選取3個水平，提取液均濃縮至50 mL，以提取液中羥基紅花黃色素A的含量為評價指標，因素水平如表2。

表2 紅花提取工藝因素水平表

2.1.3 金銀花 溶媒的選擇和提取工藝方法同2.1.2，提取液均濃縮至100 mL，以提取液中綠原酸的含量為評價指標。

2.1.4 蒲公英 溶媒的選擇和提取工藝方法同2.1.2，提取液均濃縮至50 mL，以提取液中咖啡酸的含量為評價指標。

2.2 有效成分含量檢測方法

2.2.1 黃芩苷含量測定 色譜條件流動相為甲醇-水-冰醋酸(50:50:1)；流速為1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長為278 nm；進樣量為10 μL；運行時間為30 min。

標準曲線精密稱取黃芩苷對照品100.55 mg，溶于50%甲醇中并定容至100 mL制成對照品溶液母液，分別吸取母液3、4、5、6和7 mL，加50%甲醇定容至25 mL，制成濃度分別為98.10、130.80、163.49、196.19和228.89 μg /mL的供試品溶液，按上述色譜條件分別測定5種濃度供試品的峰面積，以峰面積為縱坐標，以對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

供試品溶液的制備取按正交試驗方法提取的黃芩苷粉末，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾即得。

含量測定按上述色譜條件分別測定9個黃芩苷樣品中黃芩苷的含量。

2.2.1 羥基紅花黃色素A含量測定 色譜條件流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸(26:2:72)；流速為1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長為403 nm；進樣量為10 μL；運行時間為30分鐘。

標準曲線精密稱取羥基紅花黃色素對照品5.03 mg，溶于25%甲醇并定容至25 mL制成對照品溶液母液，分別吸取母液1、3、5、7和8 mL，加25%甲醇定容至25 mL，制成濃度分別為7.77、23.30、38.83、54.36和62.13 μg/mL的對照品溶液，按上述色譜條件分別測定5種濃度對照品的峰面積，以峰面積為縱坐標，以對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

供試品溶液的制備取按正交試驗方法提取的紅花提取液，分別吸取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加25%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾即得。

含量測定按上述色譜條件分別測定9個紅花樣品中羥基紅花黃色素的含量。

2.2.3 綠原酸含量測定 色譜條件流動相為甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)；流速為1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長為324 nm；進樣量為10 μL；運行時間為30 min。

標準曲線精密稱取綠原酸對照品10.68 mg，溶于水中并定容至25 mL制成對照品溶液母液，分別吸取母液1、3、5、7和8 mL，加水定容至50 mL，制成濃度分別為16.63、49.88、83.13、116.39和133.01 μg/mL的供試品溶液，按上述色譜條件分別測定5種濃度對照品的峰面積，以峰面積為縱坐標，以對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

供試品溶液的制備取按正交試驗方法提取的金銀花提取液，分別吸取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾即得。

含量測定按上述色譜條件分別測定9個金銀花樣品中綠原酸的含量。

2.2.4 咖啡酸含量測定 色譜條件流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉1.56 g，加水使溶解成1000 mL，再加1%磷酸溶液調節pH值至3.8～4.0，即得)(23:77)；流速為1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長為323 nm；進樣量為10 μL；運行時間為30分鐘。

標準曲線精密稱取咖啡酸對照品6.28 mg，溶于甲醇中并定容至50 mL制成對照品溶液母液，分別吸取母液3、4、5、6和7 mL，加甲醇定容至25 mL，制成濃度分別為15.06、20.08、25.10、30.12和35.14 μg/mL的供試品溶液，按上述色譜條件分別測定5種濃度對照品的峰面積，以峰面積為縱坐標，以對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

供試品溶液的制備取按正交試驗方法提取的蒲公英提取液，分別吸取5 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾即得。

含量測定按上述色譜條件分別測定9個蒲公英樣品中咖啡酸的含量。2.3 數據處理 應用“正交試驗設計助手ⅡV3.1”設計正交表，并進行數據處理。

3 結果

3.1 芩紅奶牛乳房灌注液的回歸方程和線性關系

芩紅奶牛乳房灌注液的4種成分的回歸方程和線性關系見表3。

表3 芩紅奶牛乳房灌注液4種成分的回歸方程和線性關系

3.2 芩紅乳房灌注液溶媒選擇結果 溶媒選擇結果表明，芩紅灌注液中3種中藥用3種溶媒提取有效成分含量差異不大，雖然30%或50%乙醇提取的效果稍好，但提取液較渾濁，而且濃縮時產生大量氣泡，影響濃縮效率，另外，考慮生產中的經濟因素和安全因素，3種中藥均選擇用水做溶媒。

3.3 黃芩提取正交試驗結果 黃芩苷含量測定結果見圖1。

A.黃芩苷對照品溶液；B.黃芩苷溶液圖1 黃芩苷HPLC圖

因素A加水量/倍B提取次數/次C提取時間/hD溶解沉淀加水量/倍E調堿pHF保溫時間/hG空列黃芩苷純品質量/g1821．566．5～7．00．510．6132821．587．0～7．5120．662383266．5～7．0121．824483287．0～7．50．511．5395102267．0～7．50．521．1136102286．5～7．0111．37171031．567．0～7．5111．40181031．586．5～7．00．521．501均值11．1590．9401．0441．2381．3271．1921．231均值21．3461．5661．4621．2681．1791．3151．275極差0．1870．6260．4180．0300．1480．1230．044主次順序B>C>A>E>F>D優水平A2B2C2D2E1F2優組合A2B2C2D2E1F2

表5 黃芩提取工藝的方差分析結果

F比大于F臨界值即為該因素影響顯著。

由表4直觀分析可知，各因素對黃芩提取效率影響主次順序為B>C>A>E>F>D，即提取次數影響最大，其次是提取時間和加水量，調堿pH、保溫時間和溶解沉淀加水量對提取效果影響較?。稽S芩最佳提取工藝為A2B2C2D2E1F2，即加10倍水，提取3次，每次2 h，溶解沉淀加8倍量水，加20%NaOH調pH至6.5～7.0，酸沉時保溫時間為1 h；由表5方差分析結果可知，提取次數和提取時間對黃芩提取效果具有顯著的影響。

3.4 紅花含量測定結果 羥基紅花黃色素A含量測定結果見圖2。

A.羥基紅花黃色素A對照品溶液；B.紅花提取液。圖2 紅花提取液HPLC圖

因素A加水量/倍B提取溫度/℃C提取次數/次D提取時間/h羥基紅花黃色素A含量/(mg·mL-1)11060112．0582108021．53．50931098323．59441560224．24651580314．3776159811．52．4747186031．55．16781880123．11691898214．049均值13．0543．8242．5493．495均值23．6993．6673．9353．717均值34．1113．3724．3793．652極差1．0570．4521．830．222主次順序C>A>B>D優水平A3B1C3D2優組合A3B1C3D2

表7 紅花提取工藝的方差分析結果

F比大于F 0.01臨界值即為該因素影響極顯著，F比大于F0.05臨界值即為該因素影響顯著。

根據表6直觀分析可知，各因素對紅花提取效率影響主次順序為C>A>B>D，即提取次數影響最大，其次是加水量，提取溫度和每次提取時間對提取效果影響較?。患t花最佳提取工藝為A3B1C3D2，即18倍水，60℃提取，提取3次，每次1.5 h；由表7方差分析結果可知，加水量和提取次數對紅花提取效果的影響顯著。

3.5 金銀花含量測定結果 綠原酸含量測定結果見圖3。

A.綠原酸對照品溶液；B.金銀花提取液圖3 金銀花提取液HPLC圖

因素A加水量/倍B提取溫度/℃C提取次數/次D提取時間/h綠原酸含量/(mg·mL-1)111112．461212224．003313334．371421234．479522314．984623123．093731324．876832133．322933214．585均值13．6123．9392．9594．01均值24．1854．1034．3563．991均值34．2614．0164．7444．057極差0．6490．1641．7850．066主次順序C>A>B>D優水平A3B2C3D3優組合A3B2C3D3

表9 金銀花提取工藝的方差分析結果

F比大于F0.01臨界值即為該因素影響極顯著，F比大于F0.05臨界值即為該因素影響顯著。

根據表8直觀分析可知，各因素對金銀花提取效率影響主次順序為C>A>B>D，即提取次數影響最大，其次是加水量，提取溫度和每次提取時間對提取效果影響較小；金銀花最佳提取工藝為A3B2C3D3，即18倍水，80℃提取，提取3次，每次2 h；由表9方差分析結果可知，加水量和提取次數對紅花提取效果的影響極顯著。3.6 蒲公英測定結果 咖啡酸含量測定結果見圖4。

圖4 蒲公英提取液HPLC圖A.咖啡酸對照品溶液；B.金銀花提取液

因素加水量/倍提取溫度/℃提取次數/次提取時間/h咖啡酸含量/(mg·mL-1)111110．001212220．092313330．315421230．233522310．118623120．161731320．285832130．08933210．203均值10．1360．1730．0810．107

續表

表11 蒲公英提取工藝的方差分析結果

根據表10直觀分析可知，各因素對蒲公英提取效率影響主次順序為C>B>D>A，即提取次數影響最大，其次是提取溫度，提取時間和加水量對提取效果影響較??；金銀花最佳提取工藝為A3B3C3D3，即18倍水，98℃提取，提取3次，每次2 h。由表11方差分析結果可知，各因素對蒲公英提取效果的影響均不顯著。

3.7 工藝驗證試驗 根據正交試驗結果篩選的工藝條件，對芩紅乳房灌注液的4種藥材分別進行3批驗證試驗。以最佳工藝進行提取，黃芩苷的含量約4.826 mg/mL，咖啡酸的含量約為為1.499 g/30 g，羥基紅花黃色素A的含量約為4.569 mg/mL，綠原酸含量約為0.320 mg/mL。正交試驗所得結論符合實際提取結果，且結果穩定可靠。

4 討論與小結

4.1 評價指標的選擇 浸出物是中藥復方的藥效物質基礎，浸出物中有效成分含量的變化最終影響藥物的臨床療效。芩紅乳房灌注液主要用于治療奶牛乳房炎，具有化瘀止痛、消腫通乳的功效，黃芩苷為方中君藥黃芩的主要成分，具有抑菌、抗炎等功效[8]；紅花黃色素A為方中君藥紅花藥理功效的最有效水溶性部位，可抑制血小板激活因子誘發的血小板聚集與釋放，可競爭性地抑制血小板激活因子與血小板受體的結合，是紅花黃色素的活血化瘀有效成分[9]；綠原酸是金銀花的主要抗菌、抗病毒有效藥理成分之一；蒲公英中的咖啡酸具有抗氧化、抗炎的功效。因此，本研究中考察的4種指標，均為芩紅乳房灌注液中治療奶牛乳房炎的有效成分，且含量均較高。

4.2 正交因素與水平的選擇 中藥的浸提時間主要取決于：①浸提熱力學因素，每次浸提能達到或接近浸提熱力學的平衡點，而達到平衡點需要一定的時間[10]；②浸出成分的化學穩定性，如果浸出成分的化學穩定性差，有可能在浸出過程中尚未達到平衡點就已經發生化學變化，化學穩定性差的成分在浸提時不允許提取時間太長；③浸出產品生產的時空因素，在化學成分穩定性良好的情況下，浸提時間也不能無限制的增加，要有效的利用裝置的空間和時間得到最大的產出，所以在提取時間水平的選擇上，選擇1、1.5和2 h。

中藥浸提過程中，要通過提高浸提溫度，提高分子的運動速度，較快的達到熱力學平衡點，但浸提溫度對藥材中熱敏性物質可能會有影響，如果溫度過高可能會影響其穩定性。因此，在浸提工藝中要選擇合適的浸提溫度[11]。本研究中分別設置60℃、80℃和98℃(沸騰)3個水平，研究結果表明，羥基紅花黃色素A[12]和綠原酸[13]對熱較敏感，最佳提取溫度分別為60℃和80℃。

理論上，浸提次數越多，有效成分的浸出率越高，研究表明，次數愈靠后的浸提，該次浸提的收率愈低，所以考慮到成本，本研究設置1、2和3次3個水平。研究結果表明，浸提次數對提取效果的影響較大，故芩紅乳房灌注液中4種中藥的提取均采用3次提取。

溶劑倍量越大，達到浸出平衡時的藥材浸出得率越高，考慮到成本等因素，本研究設置10倍、15倍和18倍加水量3個水平。

4.3 小結 本研究通過正交試驗確定4味中藥的提取工藝，黃芩最佳提取工藝為A2B2C2D2E1F2，即加10倍水，提取3次，每次2 h，溶解沉淀加8倍量水，加20%NaOH調PH至6.5～7.0，酸沉時保溫時間為1 h；紅花最佳提取工藝為18倍水，60℃提取3次，每次15 h；金銀花最佳提取工藝為18倍水，80℃提取3次，每次2 h；蒲公英最佳提取工藝為18倍水，98℃提取3次，每次2 h。芩紅奶牛乳房灌注液提取工藝的研究為其規模生產及臨床應用奠定了基礎。

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(編輯：陳希)

Study on Extraction Technology of Qinhong Breast Perfusion in Cow

SUN Hong-ran, YANG Hai-ming, CHEN Zhi-qiang*, SHANG Jing-xue

(InnerMongoliaAlexHuaTianPharmaceuticalCo.,Ltd.InnerMongolia,Chifeng024070,China)

This paper preparated to confirm the best extraction process of Qinhong breast perfusion in cow. This research through the orthogonal experiment, the optimum choice appropriate solvent, the amount of water, extraction temperature, extraction time, extraction times, determined the best extraction process of Qinhong breast perfusion in cow.These tests laied the foundation for production and clinical application of Qinhong breast perfusion in cow.

Qinhong breast perfusion in cow;extraction technology; orthogonal test

孫宏冉，碩士研究生，從事中藥制劑方面研究。

陳志強。E-mail：zhq_chen@163.com

2016-06-28

A

1002-1280 (2016) 09-0026-08

S853.7