“肺腸同治”法對膿毒癥大鼠肺基質金屬蛋白酶及其抑制物表達的影響

陳素珍 樓黎明 胡丹丹 黃立搜 王世強 徐一凱 章 潛

“肺腸同治”法對膿毒癥大鼠肺基質金屬蛋白酶及其抑制物表達的影響

陳素珍 樓黎明 胡丹丹 黃立搜 王世強 徐一凱 章 潛

目的根據“肺合大腸”理論擬定治肺、治腸、肺腸同治方藥，觀察不同治法對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比值的變化，探討“肺腸同治”法治療膿毒癥肺損傷的作用機制。方法將清潔級SD雄性大鼠50只隨機分為假手術組、模型組、治肺組、治腸組、肺腸同治組，每組10只。以盲腸結扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥大鼠模型，觀察CLP術后24h大鼠肺組織勻漿中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比值、肺濕/干重比（W/D）的情況。結果與假手術組比較，模型組、治肺組、治腸組、肺腸同治組大鼠肺濕/干重比均明顯增大（P＜0.01）；與模型組比較，治肺組、治腸組、肺腸同治組的大鼠肺濕/干重比均顯著減小（P＜0.01或P＜0.05）。與假手術組比較，模型組、治肺組、治腸組、肺腸同治組的大鼠MMP-9、TIMP-1顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），TIMP-1/MMP-9比值顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，治肺組、治腸組、肺腸同治組大鼠MMP-9降低[（12.56±0.76）、（12.50±0.98）、（10.50±0.71）比（14.80±0.59），P＜0.05]，TIMP-1顯著下降[（14.10±1.12）、（14.30±1.30）、（10.90±0.53）比（17.70±1.06），P＜0.05]，TIMP-1/MMP-9比值顯著升高[（0.91±0.04）、（0.90±0.04）、（0.98±0.03）比（0.84±0.03），P＜0.05]。結論“治肺”法、“治腸”法、“肺腸同治”法均可以下調肺損傷模型大鼠肺組織MMP-9基因與TIMP-1基因表達，從而減輕膿毒癥大鼠的肺損傷，對肺臟有一定的保護作用，其中以肺腸同治法效果最好。

大鼠；膿毒癥；肺腸同治；MMP-9；TIMP-1

膿毒癥是指感染引起的全身炎癥反應綜合征（SIRS），是目前ICU中的首要死亡原因，具有患病率、病死率、治療費用高等特點[1-2]。在膿毒癥所致的多器官功能不全（MODS）中，常是最早受損的器官，臨床表現為進行性呼吸困難、紫紺、氣促喘憋等急性肺損傷的肺氣壅遏的癥狀，常同時伴有便秘腹脹等腑氣不通、大腸失于傳導的病理變化，其證候學體現了中醫“肺合大腸”的特點[3-6]。本實驗通過觀察膿毒癥大鼠的肺組織中基質金屬蛋白酶-9（MMPs-9）及基質金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMPs-1）表達，探討“肺腸同治”治法機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，體質量220～250g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供并常規飼養，實驗動物合格證號“SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物及主要試劑 治肺方（生石膏、苦杏仁、瓜蔞皮）、治腸方（生石膏、芒硝、厚樸、枳實）、肺腸同治方（生石膏、苦杏仁、瓜蔞皮、生大黃、芒硝、厚樸、枳實）中藥顆粒劑，購自浙江中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，生藥劑量比例按照文獻換算[7]。各方煎煮濃縮后含生藥0.65g/mL，依照人體單位體質量生藥量求得大鼠的單位體積質量生藥量，4℃冰箱保存備用。MMP-9、TIMP-1等試劑購自Cusabio生物公司（其中TIMP-1試劑盒序列號：CSB-E08005r,MMP-9試劑盒序列號：CSB-E08008r）。

2 實驗方法

2.1 膿毒癥模型建立[5-6]SD大鼠適應性飼養1周，膿毒癥模型采用經典的盲腸結扎穿孔法（CLP）方法加以改進。具體如下：實驗前12h禁食不禁水，實驗時稱重。腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，以腹正中線作一1.5cm長的切口，找到盲腸，在其根部結扎，用18號針穿通3次，輕擠出少量場內容物，留置2mm皮瓣防止針孔閉合，還納盲腸于腹腔，逐層縫合腹壁切口，術畢皮下注射生理鹽水抗休克。操作中注意消毒，術后保暖。其中假手術組不行盲腸結扎與穿孔，余操作相同。

2.2 分組和給藥 將SD大鼠按隨機分配原則分為五組，每組10只：假手術組、模型組、治肺組、治腸組、肺腸同治組。治肺組、治腸組、肺腸同治組：造模前予相應藥物灌胃（1mL/100g），1天1次，3天，于第3次灌胃后2h行CLP術造模，于術后24h麻醉并腹主動脈采血致死。余各組均于設定的相應時相點，給予相應的藥物，其中假手術組和模型組均予生理鹽水。

2.3 標本采樣和制備

2.3.1 血清標本 然后用2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉，仰臥固定乙醇消毒后，打開腹腔，暴露腹主動脈，緩慢取血，離心后得到上清液，轉入EP管，于-70℃凍存。

2.3.2 肺組織標本 經采血處死后，取大鼠左肺放入無菌低溫凍存管，于液氮中速凍，轉存到-70℃冰箱保存備用，待全部實驗結束后采用ELISA法測定肺組織勻漿中MMP-9、TIMP-1的含量；取右肺上葉，精確稱濕重，再置于85℃烤箱中24h，至重量不再變化，稱干重，計算肺濕/干重比。

2.4 指標檢測

2.4.1 血氣分析 獲取處理后大鼠動脈血，采用全自動血氣分析機檢測PaO2/FiO2。

2.4.2 MMP-9、TIMP-1測定 ELISA檢測大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1含量，操作嚴格按說明書進行。

2.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，數據以均值±標準差（±s） ，計量資料采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時作兩兩比較用LSD法，方差不齊時選Dunnett's T3法；P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血氣分析 與假手術組相比，模型組PaO2/FiO2含量顯著降低（P＜0.05）。治肺組和治腸組的PaO2/FiO2較模型組升高（P＞0.05），但低于假手術組（P＜0.05），肺腸同治組則較模型組明顯增高（P＜0.05），已非常接近假手術組。見表1。

3.2 各組大鼠肺組織濕/干重比（W/D）變化 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織W/D明顯增加（P＜0.05）；治肺組、治腸組和肺腸同治組的肺組織W/D也顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，治肺組、治腸組和肺腸同治組大鼠肺組織W/D顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動脈血PaO2/FiO2和肺W/D比較（±s）

表1 各組大鼠動脈血PaO2/FiO2和肺W/D比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05

3.3 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1蛋白水平變化 與假手術組比較，模型組、治肺組、治腸組和肺腸同治組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1均明顯升高（P＜0.05），而TIMP-1/MMP-9比值則顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，治肺組、治腸組或肺腸同治組大鼠MMP-9和TIMP-1顯著下降，而MMP-9/ TIMP-1比值增高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1比值比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1比值比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9；TIMP-1：基質金屬蛋白酶抑制因子-1

組別假手術組模型組治肺組治腸組肺腸同治組鼠數10 10 10 10 10 MMP-9（ng/mL）9.18±0.59 14.80±0.59* 12.56±0.76*#12.50±0.98*#10.50±0.71##TIMP-1（ng/mL）9.05±0.53 17.70±1.06* 14.10±1.12*#14.30±1.30*#10.90±0.53#比值1.01±0.04 0.84±0.03* 0.91±0.04*#0.90±0.04*#0.98±0.03*##

4 討論

基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）家族包含超過20類的細胞分泌因子和細胞表面酶，它們可以降解細胞外基質蛋白、凝血因子、脂蛋白、生長因子，并具有趨化細胞等作用[6-7]。MMP-9則被認為在ALI/ARDS的發生和進展中起著重要的作用[8-9]。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，因其作用底物廣泛，表達細胞眾多而備受重視。正常情況下MMP-9不在肺組織內表達，當炎性細胞被激活時，炎性因子大量釋放，而促進MMP-9高表達[10]。膿毒癥時，MMP-9可以增強放大炎癥因子的效應，使中性粒細胞遷移在肺組織局部浸潤，刺激肺組織局部的實質細胞釋放出MMPs，放大并增加對肺組織的損傷。

金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的天然抑制物，其中TIMP-1是MMP-9的生理性抑制物，是一種以可溶性形式分泌到ECM中的糖蛋白，它以1：1的分子比例與MMP-9酶原的活化形式非共價結合，結合是不可逆而穩定的。Lauchou等[11]研究表明，MMP-9與TIMP-1比例失衡參與氣道重建影響ARDS病程的長短。MMP-9與TIMP-1比值可能成為ARDS病程進展的預測值。Muhl等[12]對入住ICU的嚴重膿毒癥患者進行動態MMPs及TIMPs觀察,發現TIMP-1顯著升高并隨著時間而衰減,MMP-9/TIMP-1比值在最初的3天內顯著降低。

本實驗發現，模型組大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1蛋白的表達強度均高于假手術組，P＜0.05或P＜0.01，與之前的報道[13]相符，提示MMP-9和TIMP-1參與了急性膿毒癥肺損傷的發生發展。治肺組和治腸組給藥治療后，MMP-9和TIMP-1蛋白表達較模型組減少（P＜0.05），而MMP-9和TIMP-1蛋白表達在肺腸同治組中降低更明顯，與假手術組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組相比，模型組MMP-9/TIMP-1比值顯著減低；肺腸同治組MMP-9/ TIMP-1較模型組明顯增高，這也與肺腸同治組對W/D比值和血氣分析影響效果一致。

本實驗說明，治肺組、治腸組，尤其是肺腸同治組均能明顯降低血漿TIMP-1蛋白含量，改善MMP-9/TIMP-1的平衡，抑制了MMP-9和TIMP-1在肺內的異常高度表達，促進MMPs/TIMPs的失衡狀態恢復，預防膿毒癥時肺損傷的發生。

近年來，中醫治療膿毒癥取得一定的進展，“通利大腸”是治療膿毒癥的大法之一[3-4]。其理論基礎源于《黃帝內經》記載的“肺合大腸，大腸者，傳導之腑”。而“肺咳不已，則大腸受之。大腸咳狀，咳而遺矢”則表明了肺與大腸不僅在生理方面密切相關，而且在病理上也存在相互影響和傳變關系，肺失肅降，氣機不利，影響大腸傳導功能，導致腑氣不通；腸腑壅實，腑氣不利，陽明濁氣上犯于肺，影響肺臟的宣發肅降，導致肺功能損害。急性膿毒癥肺損傷常因腸腔內的細菌大量繁殖與毒素吸收入血，通過腸源性內毒素導致對肺臟的損害。其病機根本在于肺壅腸閉，肺壅則喘，腸閉則滿。故本方治以通腑除滿、清肺平喘。通腑湯的意義不在于瀉下腑實，而是釜底抽薪，通下氣機，肺氣以降為順，通腑湯通過降大腸之氣而順應肺氣生理趨勢，疏導止喘，以瀉代補。微下之，恰恰反映通腑湯之功用不在瀉實，而在于順氣調和下逐之間。已有的臨床和實驗研究證實，單純“清熱解毒利肺”或“通利大腸”均可調節膿毒癥患者的炎癥介質、免疫功能及凝血功能。

本實驗通過對膿毒癥大鼠肺臟病理學、肺濕/干重比變化、肺組織MMP-9/TIMP-1水平變化，顯示膿毒癥肺損傷存在肺基質金屬蛋白酶及其抑制物表達異常；“肺腸同治”可更有效改善膿毒癥肺損傷，其作用機制可能與抑制MMP-9的過度表達，調節失衡的MMP-9/TIMP-1，進而減輕肺組織損傷有關。

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（收稿：2015-11-09 修回：2016-02-22）

Effect of"Treat Lung and Colon Together"Prescription on the Expression of MMP-9 and TIMP in Rats with Sepsis

CHEN Suzhen,LOU Liming,HU Dandan,HUANG Lisou,WANG Shiqiang,XU Yikai,ZHANG Qian. Department of Respiratory Disease,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China

ObjectiveAccording to the"Treat Lung and Colon Together"theory,we developed prescriptions for the treatment of lung,colon and both,respectively.This study aimed to observe the effectof these prescriptions on the level of metalloproteinase-9（MMP-9）,TIMP-1（metallopeptidase inhibitor 1）and the ratio of MMP-9/TIMP-1 in lung tissue of rats with acute lung injury and to explore the underlying mechanism.MethodsFifty SD male rats were randomly divided into 5 groups with 10 in each group：sham operation group,model group,lung treatment group,colon treatment group,lung and colon treatment group.Cecal ligation and puncture（CLP）was used to generate sepsis in rats in all groups except sham operation group;the level of MMP-9 and TIMP-1 and the ratio of MMP-9/TIMP-1 in lung tissue and lung wet/dry weight ratio（W/D）were observed in 24h after CLP.ResultsCompared with sham operation group,the W/D ratio was increased in model group and lung,colon or lung and colon treatment groups（P＜0.01）;compared with the model group,the W/D ratio was decreasedin lung,colon or lung and colon treatment groups（P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with sham operation group,the level of MMP-9 and TIMP-1 wasregulated and the ration of TIMP-1/MMP-9 was decreased in treatment groups（P＜0.01 or P＜0.05）; compared with model group,lung,colon or lung and colon treatment groups had lower levels of MMP-9（12.56± 0.76,12.50±0.98,10.50±0.71 vs 14.80±0.59）and TIMP-1（14.10±1.12,14.30±1.30,10.90±0.53 vs 17.70±1.06）andhigher ration of TIMP-1/MMP-9（0.91±0.04,0.90±0.04,0.98±0.03 vs 0.84±0.03）,with all P＜0.05.ConclusionThe prescriptions from the"Treat Lung and Colon Together"theory can reduce the level of MMP-9 and decrease TIMP-1 in rats with sepsis,which is benefit to ameliorating lung injury.The effect is more prominent in lung and colon treatment group.

rats;sepsis;"Treat Lung and Colon Together"theory;MMP-9;TIMP-1

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2012ZB069），浙江中醫藥大學課題（No.2013ZR03）

浙江中醫藥大學附屬第三醫院呼吸科（杭州 310005）

樓黎明，Tel：0571-88393530；E-mail：llm2348@hotmail.com