源自黃斑籃子魚腸道菌群的B30菌株降解滸苔多糖的活性研究

謝羅瀚，韓學鳳，張志標，李 進，張青巖，鐘名其*，胡 忠

（1.汕頭市金山中學，廣東汕頭 515073；2.汕頭大學生物系，廣東汕頭 515063）

源自黃斑籃子魚腸道菌群的B30菌株降解滸苔多糖的活性研究

謝羅瀚1,a，韓學鳳2,a，張志標2，李 進2，張青巖1，鐘名其2*，胡 忠2

（1.汕頭市金山中學，廣東汕頭 515073；2.汕頭大學生物系，廣東汕頭 515063）

以滸苔多糖作為唯一碳源，從黃斑籃子魚腸道菌群篩選得到一株能夠降解滸苔多糖的菌株，經16S rDNA鑒定為Vibrio sp.B30；其產滸苔多糖降解酶的最適條件為培養時間24 h、溫度30℃、起始pH值為7、最適氮源為硫酸銨.該酶的最適反應催化溫度為50℃、pH值為7，并且10 mmol/L的鈣離子或鈉離子能夠較明顯提高該酶酶活力.0.5 g/L和1 g/L的NP40、聚氯乙烯月桂醚、Tween80、Tween20、TritionX-100表面活性劑對滸苔多糖降解酶活力具有一定的提高作用.

滸苔多糖；降解；Vibrio sp.B30；黃斑籃子魚腸道菌群

滸苔這一綠藻資源非常豐富，滸苔中滸苔多糖的含量高達50%.滸苔多糖在一定分子量范圍內具有降血糖、提高免疫力、抗腫瘤等生物學活性[1-2]；在輔助劑作用下可生成活性炭[3]；同時滸苔多糖被降成還原糖可作為一種新型的生物能源[4].但是由于滸苔多糖分子量大，所以滸苔多糖在應用方面受到了很大的限制[1].將大分子的海藻多糖降解為低分子量的寡糖是當前研究的重點和熱點.目前將大分子的海藻多糖降解為小分子的寡糖的降解方法主要有物理法、化學法、酶法.酶降解法是利用酶作為一種特殊的生物催劑，具有極強的底物和產物專一性，可選擇性地酶解特定糖苷鍵得到特定寡聚糖，還不造成環境污染.

許多海洋動物都喜歡以海藻為食物，因此海洋動物消化道內存在著豐富的多糖降解酶.Sugita等[5]研究發現在魚腸道和梭子蟹中廣泛存在著產酶菌株.Romanenko等[6]從海洋無脊椎動物中分離到了一株新的瓊脂降解菌Glaciecola mesophila KMM241.Cieslinski等[7]從南極磷蝦消化道中分離得到產β-半乳糖苷酶的菌株Pseudoalteromonas sp.22b，對該基因進行了克隆表達及酶學性質的分析.2013年，冷曉飛等[8]對養殖和野生皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）不同個體間腸道菌群數量和種類組成進行了研究，并采用PCR-DGGE指紋技術對比分析了二者腸道優勢菌群的差異；他們發現，養殖和野生皺紋盤鮑腸道優勢菌基本相同，均為弧菌屬Vibrio，次優勢菌均為玫瑰桿菌屬（Roseobacter）和希瓦氏菌屬（Shewanella）.

黃斑籃子魚喜好以滸苔為食物，腸道內可能存在著豐富的能夠降解滸苔多糖的微生物資源及酶資源；最近，本課題組Zhang等[9]從黃斑籃子魚的腸道菌群分離到能降解滸苔多糖的一個微生物菌群.本研究進一步從黃斑籃子魚的腸道菌群分離能利用滸苔多糖的微生物單菌，并研究了其產滸苔多糖降解酶的能力.

1 材料與方法

1.1 實驗材料、化學試劑及培養基

黃斑籃子魚由漁民從汕頭市南澳海區捕捉，并用滸苔作為飼料對籃子魚進行馴養.

胰蛋白胨和酵母提取物均為MDBio公司產品，其他無機鹽等試劑為上海生工生物工程公司分析純試劑，2×PCR TaqMix、PCR產物凝膠回收試劑盒購買于廣東東盛生物科技有限公司.DNAmaker、pMD19-T vector購買于TaKaLa公司，RNAse A、蛋白酶K和溶菌酶購買于Sigma公司.菌株Escherichia coli 5α為本實驗室保存.博檢革蘭氏陰性細菌鑒定系統購買于青島海博生物有限公司.

3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：3,5二硝基水楊酸1%，亞硫酸鈉0.05%，氫氧化鈉1%，酒石酸鈉20%，苯酚0.2%；配好后存儲于棕色瓶一周后使用.

人工海水：NaCl 20 g；MgCl2·6H2O 3.0 g；MgSO4·7H2O 6.0 g；（NH4）2SO41.0 g；NaHCO30.2 g；CaCl2·2H2O 0.3 g；KCl 0.5 g；KH2PO40.42 g；NaBr 0.05 g；SrCl·6H2O 0.02 g.

滸苔多糖降解酶篩選培養基：取10 g滸苔加500 mL水于90℃水浴鍋中浸提3 h后用紗布過濾掉滸苔殘渣，6 000 rpm離心10 min取上清液；直接用人工海水與上清液混合，配制成以滸苔多糖為唯一碳源的選擇培養基.

1.2 滸苔多糖降解菌的篩選及理化特性分析

對黃斑籃子魚的體表進行消毒后，在無菌條件下取出腸道，再用滅菌的鑷子挑出除腸道外的其他籃子魚器官，加入10 mL的生理鹽水進行剪碎；然后用滅菌的紗布過濾、再梯度稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6的梯度后涂布于含滸苔唯一碳源的固體培養基上；挑取能在培養基上生長的菌落，通過液體培養的發酵液中滸苔多糖降解酶活力的測定（DNS法）來初步確定該菌是否具有滸苔多糖降解能力.

利用購買的革蘭氏陰性菌鑒定系統，對滸苔多糖降解菌進行生理生化特性研究，主要有20個特性試驗，如：ONPG、精氨酸（ADH）、賴氨酸（LDH）、鳥氨酸（ODC）、檸檬酸（CIT）、硫化氫（H2S）、脲酶（URE）、乳糖（LAC）、吲哚（IND）、VP、明膠（GEL）、葡萄糖（GLU）、甘露醇（MAN）、肌醇（INO）、山梨醇（SOR）、鼠李糖（RHA）、蔗糖（SAC）、蜜二糖（MEL）、苦杏仁甙（AMY）、阿拉伯糖（ARA）.

1.3 滸苔多糖降解菌的分子鑒定

滸苔多糖降解菌DNA的提取參考SDS-CTAB法進行.利用細菌16SrDNA的通用引物27F（5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’）和1492R（5’-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TTC-3’），以菌液DNA為模板，進行PCR反應.將PCR擴增產物用凝膠回收試劑盒進行回收，然后連接于pMD19-T vector上，轉化進E.coli DH5α.挑取克隆子，并用pMD19-T vector上的通用引物M13進行驗證，將陽性克隆送華大基因公司進行測序，測序回來的結果去除載體后，使用NCBI在線軟件BLAST與已知微生物的16S rDNA進行相似性分析.

1.4 滸苔多糖降解菌粗酶液的制備及酶活檢測

取-70℃保存滸苔多糖降解菌種，平板劃線進行活化，挑取單菌落接種到含8 mL滸苔多糖培養基的試管中，在30℃、150 rpm下振蕩培養8 h；以1%的比例接種到100 mL培養基中振蕩培養36 h，4℃、9 000 rpm離心8 min沉淀菌體，上清液即為粗酶液.

按照DNS法，取1 mL粗酶液加入到1 mL 1%的滸苔多糖溶液中，50℃反應30 min；加入2 mL DNS，在沸水浴中煮10 min顯色.然后向試管中加入4 mL蒸餾水，稀釋后用紫外可見光光度計于540 nm處測OD值，以滅活酶液為對照.以OD值提高0.001定義為一個酶活力單位（U）.

1.5 菌株產滸苔多糖降解酶發酵條件

將菌株按1%比例接種于添加滸苔多糖的培養基中，搖床轉速150 rpm，分別在不同培養時間（12～60 h）、培養溫度（25～40℃）、培養基起始pH（6.0～9.0）、不同氮源（蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素、酵母提取物）條件下培養，測定其發酵液的酶活力.

1.6 滸苔多糖降解酶部分性質分析

1.6.1 最適催化溫度

取1.0 mL滸苔多糖降解酶酶液，加入1.0 mL、1%的滸苔多糖，分別在不同溫度（30～60℃）中反應30 min，檢測酶活.

1.6.2 pH值對酶活力的影響

配制pH值為6、7、8、9、10的緩沖液，再用其分別配制1%滸苔多糖溶液.然后取1 mL的粗酶液分別與不同pH值的底物于50℃水浴鍋反應30 min后，檢測其酶活.

1.6.3 金屬離子對酶活力的影響

配制的1%滸苔多糖底物中加入1 mL的粗酶液，分別加入終濃度為10 mmol/L和25 mmol/L的鈣、鎂、鈉、鉀離子，50℃反應30 min后檢測酶活.

1.6.4 表面活性劑對酶活力的影響

在以pH值為7的緩沖液中配制的1%滸苔多糖為底物，加入1 mL的粗酶液，然后分別添加終濃度為0.5 g/L和1 g/L的NP40、聚氯乙烯月桂醚、Tween80、Tween20、TritionX-100、Trition114，再于50℃水浴鍋反應30 min后檢測其酶活.

2 結果與分析

2.1 滸苔多糖降解菌株B30的分離及鑒定

通過富集培養和初篩，從黃斑籃子魚腸道內共獲得37株滸苔多糖降解菌，使用DNS法鑒定其產滸苔多糖降解酶的能力，發現大部分菌株的產酶能力不高；最后，選擇酶活力較高的菌株B30作為研究對象.

使用通用引物27F和1492R，對菌株B30進行PCR擴增，獲得的16S rDNA序列擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1；同時，送深圳華大基因有限公司進行測序.將測序所得菌株B30的16S rDNA序列提交到NCBI做blastn程序對比分析，并構建菌株B30的系統進化樹，如圖2.結果表明，該菌株與Vibrio fluvialis具有99%的相似性，因此將該菌株歸于Vibrio屬，命名為Vibrio sp.B30.

圖1 菌株B30 16S rDNA的PCR擴增產物電泳分析

圖2 菌株B30的16S rDNA序列的系統進化樹

2.2 菌株B30的生理生化特性

按照博檢革蘭氏陰性菌鑒定系統說明書操作，得到菌株B30的基本生理生化結果，如表1.菌株B30可以利用吲哚、檸檬酸、明膠、甘露醇、阿拉伯糖等.

表1 菌株B30的生理生化特性

2.3 培養條件對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響

2.3.1 培養時間

分別設置了12 h、24 h、36 h、48 h、60 h等5個不同的發酵時間，研究了不同培養時間對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響.由圖3可知，該菌株在培養24 h時，其產滸苔多糖水解酶的能力最高；隨著培養時間的延長，其酶活力降低.

2.3.2 培養溫度

分別設置25℃、30℃、35℃、40℃等4個培養溫度，研究了不同培養溫度對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響.由圖4可知，B30最佳產酶溫度為30℃；隨著溫度的提高，產酶量迅速下降.

圖3 培養時間對菌株B30產滸苔多糖酶能力的影響

圖4 培養溫度對菌株B30產滸苔多糖酶能力的影響

2.3.3 培養基起始pH值

分別配置pH值為6、7、8、9的滸苔多糖培養基，研究了培養基中不同起始pH值對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響.由圖5可知，菌株B30在起始pH值為7時酶活力最高，在pH值9時還具有一定的滸苔多糖降解酶活力；說明該菌株可以適應一定的堿性環境.

2.3.4 不同N源

實驗中分別設置了蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素、酵母膏5種氮源，研究了不同氮源對菌株B30產滸苔多糖降解酶能力的影響.由圖6可知，菌株發酵產滸苔多糖降解酶的最適氮源為硫酸銨，其氮源的影響依次為：硫酸銨＞蛋白胨＞酵母膏＞氯化銨＞尿素.

圖5 起始pH值對菌株產滸苔多糖酶能力的影響

圖6 N源對菌株B30產滸苔多糖酶能力的影響

2.4 菌株B30滸苔多糖降解酶的性質

2.4.1 最適催化溫度

分別設置了30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等7個反應溫度，研究了不同反應溫度對菌株B30產生的滸苔多糖降解酶能力的影響，結果如圖7所示.從圖7中可知，菌株B30產生的滸苔多糖降解酶最適合的催化溫度為50℃；隨著溫度的升高，酶活迅速下降.

2.4.2 pH值對酶活力的影響

配制pH值為6、7、8、9、10的滸苔多糖底物，然后取1 mL的粗酶液分別與不同pH值的底物于50℃水浴鍋反應30 min后檢查其酶活.由圖8可知，該酶的最適催化pH值為7，高于或低于pH值為7的條件下酶活性明顯降低.

圖7 反應溫度對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響

2.4.3 金屬離子對酶活力的影響

配制的1%滸苔多糖底物中分別加入1 mL的粗酶液，再加入終濃度分別為10 mmol/L和25 mmol/L的鈣、鎂、鈉、鉀等離子，結果如圖9.從圖9中可發現，10 mmol/L的鈣離子、鈉離子能夠較明顯提高菌株B30的滸苔多糖水解酶酶活力，10 mmol/L鉀離子對滸苔多糖水解酶酶活力的提高作用較不明顯，10 mmol/L鎂離子能夠抑制滸苔多糖水解酶酶活力.25 mmol/L的鈣、鎂、鈉、鉀等離子對滸苔多糖水解酶的酶活力均沒有提高作用.

2.4.4 表面活性劑對酶活力的影響

以pH值為7的緩沖液配制1%的滸苔多糖為底物，由圖10可知，終濃度分別為0.5 g/L和1 g/L的表面活性劑中，Trition114對滸苔多糖降解酶酶活力沒有提高作用，其它的表面活性劑均能提高滸苔多糖降解酶酶活力.

圖8 pH值對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響

圖9 金屬離子對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響

圖10 表面活性劑對菌株B30產滸苔多糖降解酶的影響

3 討論

目前關于滸苔多糖的研究報道多集中在滸苔多糖的提取、結構及其活性的研究[1,10]，而關于微生物降解利用滸苔多糖的報道不多.

2011年，趙超[11]從紅樹林篩選到一株能夠利用滸苔多糖的降解菌株XQ12，研究發現其產酶能力也不高，這可能與滸苔多糖的復雜結構有關系.緊接著，Zhao等[12]繼續從紅樹林中獲得一個穩定高效的滸苔降解菌群D2-1，并發現在混合菌群D2-1中果膠酶活性遠高于纖維素酶及木聚糖酶，表明在該菌群中產果膠酶的菌株起到了重要的作用.2013年，Li等[13]從青島海洋沉積物中也篩選得到了一株滸苔多糖降解菌株Alteromonas sp.A321.最近，本課題組[9]利用嗜好以滸苔為食物的黃斑籃子魚進行研究，從其腸道菌群中分離到一個能降解滸苔多糖的微生物菌群.以此為基礎，本研究進一步從黃斑籃子魚的腸道菌群中分離能利用滸苔多糖的微生物單菌，結果發現用DNS法進行復篩滸苔多糖降解菌株的時候，菌株產滸苔多糖降解酶的能力都不高；而只有菌株B30產滸苔多糖降解酶的能力較強，并具有性狀穩定、易于培養的特點.

Li等[13]利用獲得的滸苔多糖降解菌Alteromonas sp.A321，對菌株產滸苔多糖降解酶的最適條件進行了優化，培養基的最佳組成為K2HPO40.15%、PE 0.9%、NaNO30.4%、NaCl 1.0%、MgSO40.05%；而影響滸苔多糖降解酶生產的理化因素中，最適溫度為32℃、起始pH值為7.3.在氮源的作用中，依次為：NaNO3＞牛肉膏＞蛋白胨＞酵母膏＞(NH4)2SO4＞大豆粉＞NH4NO3＞NH4Cl尿素，在不同的氮源中Na-NO3對于菌株生產滸苔多糖降解酶的效果最好.本研究也對菌株B30產滸苔多糖降解酶的最適條件進行了優化，發現培養時間24 h、溫度30℃、起始pH值為7下產酶能力較強；同時，最適的氮源為硫酸銨，而尿素的效果也最差.此外，還證實了該酶的最適反應催化溫度為50℃、pH值為7，并且10 mmol/ L的鈣離子、鈉離子能夠較明顯提高該酶的酶活力.

目前為止，國內外對微生物利用滸苔多糖機制、滸苔多糖降解酶的研究極少，嚴重影響了滸苔多糖的規模化利用.Han等[14]通過MALDI-TOF-TOF質譜技術獲得了菌株Alteromonas macleodii B7的胞外能夠降解滸苔多糖的淀粉酶AmySTU，并對其進行了克隆表達，底物特異性驗證了重組酶具有降解滸苔多糖的功能.今后將進一步對菌株B30的滸苔多糖降解酶及利用滸苔多糖的機制開展深入研究，為滸苔多糖的高值化利用奠定基礎.

[1]韓學鳳，張志標，林伯坤，等.滸苔多糖研究進展[J].汕頭大學學報（自然科學版），2014，29（3）：46-50.

[2]魏鑒騰，裴棟，劉永峰，等.滸苔多糖的研究進展[J].海洋科學，2014，38（1）：91-95.

[3]Gao Y，Yue Q Y，Sun Y Y，et al.Optimization of high surface area activated carbon production from Enteromorpha prolifra with low-dose activating agent[J].Fuel Processing Technology，2015，132：180-187.

[4]Kim D H，Lee S B，Jeong G T.Production of reducing sugar from Enteromorpha intestinalis by hydrothermal and enzymatic hydrolysis[J].Bioresource Technology，2014，161：348-353.

[5]Sugita H，Kawasaki J，Kumazawa J，et al.Production of amylase by the intestinal bacteria of Japanese coastal animals[J].Letters in Applied Microbiology，1996，23（3）：174-178.

[6]Romanenko L，Zhukova N，Rohde M，et al.Glaciecola mesophila sp.nov.，a novel marine agar-digesting bacterium[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53（Pt 3）：647.

[7]Cieslinski H，Kur J，Bialkowska A，et al.Cloning，expression，and purification of a recombinant cold-adapted beta-galactosidase from Antarctic bacterium Pseudoalteromonas sp.22b[J].Protein Expression and Purification，2005，39（1）：27-34.

[8]冷曉飛，姜海峰，劉小林，等.皺紋盤鮑腸道菌群組成及PCR-DGGE+指紋圖譜分析[J].海洋科學，2013，37（5）：10-14.

[9]Zhang Z B，Han X F，Xu Y，et al.Biodegradation of Enteromorpha polysaccharides by intestinal micro-community from Siganus oramin[J].Journal of Ocean University of China，2016，15（6）：1034-1038.

[10]石學連，張晶晶，宋厚芳，等.滸苔多糖的分級純化及保濕活性研究[J].海洋科學，2010，34（7）：81-85.

[11]趙超.綠藻滸苔生物降解及其利用的分析研究[D].廣州：中山大學，2011.

[12]Zhao C，Ruan L.Biodegradation of Enteromorpha prolifera by mangrove degrading micro-community with physical-chemical pretreatment[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，92（4）：709-716.

[13]Li Y，Wang J，Yu Y，et al.Production of enzymes by Alteromonas sp.A321 to degrade polysaccharides from Enteromorpha prolifera[J].Carbohydrate Polymers，2013，98（1）：988-994.

[14]Han X，Lin B，Ru G，et al.Gene Cloning and Characterization of an α-Amylase from Alteromonas macleodii B7 for Enteromorpha Polysaccharide Degradation[J].Journal of Microbiology and Biotechnology.2013，24（2）：254-263.

A Study ofEnteromorphaPolysaccharides-Degraded Ability of Strain B30 fromSiganus OraminIntestina

XIELuo-Han1,a,HANXue-Feng2,a,ZHANGZhi-Biao2,LIJin2,ZHANGQing-Yan1, ZHONGMing-Qi2,*,HUZhong2
（1.Jinshan Middle School of Shantou,Shantou,Guangdong,515073; 2.Biology Department of Shantou University,Shantou,Guangdong,515063）

An Enteromorpha polysaccharides-degrading strain Vibrio sp.B30 is isolated from Siganus oramin intestinal using E.polysaccharides as the sole carbon source.The optimum fermentation conditions for producing E.polysaccharides lyase are cultivated 24h at 30℃,the initial pH 7,and the most suitable nitrogen source is ammonium sulfate.The E.polysaccharides lyase can be enhanced by Ca2+,Na+and surfactant NP40, Tween80,Tween20,TritionX-100.Vibrio sp.B30 from S.oramin intestinal can use E.polysaccharides as the sole carbon source.

Enteromorpha polysaccharide;degradation;Vibrio sp.B30;Siganus oramin intestina

X 172

：A

：1007-6883（2016）06-0049-07

責任編輯 朱本華 周春娟

2016-03-30

廣東省自然科學基金項目（項目編號：S2011030005257）.

謝羅瀚（1999-），男，湖南攸縣人，汕頭市金山中學在讀學生.a：并列第一作者；*：通訊作者.