中緬邊境地區惡性瘧原蟲株裂殖子頂端膜抗原1 (PfAMA1)Domain I的基因多態性分析

馮永輝，于曉飛，曹雅明，朱曉彤*

(1.中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧沈陽110001;2.中國醫科大學附屬第四醫院神經內科，遼寧沈陽110032;3.中國醫科大學基礎醫學院免疫教研室，遼寧沈陽110122)

中緬邊境地區惡性瘧原蟲株裂殖子頂端膜抗原1 (PfAMA1)Domain I的基因多態性分析

馮永輝1，3，于曉飛2，曹雅明3，朱曉彤3*

(1.中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧沈陽110001;2.中國醫科大學附屬第四醫院神經內科，遼寧沈陽110032;3.中國醫科大學基礎醫學院免疫教研室，遼寧沈陽110122)

明確中國和緬甸邊境地區惡性瘧原蟲疫苗候選抗原PfAMA1蛋白的基因特點。收集中緬邊境地區88例惡性瘧原蟲感染患者血樣，制備血樣濾紙片;試劑盒提取惡性瘧原蟲基因組DNA(gDNA);PCR和測序檢測分析惡性瘧原蟲PfAMA1基因的Domain I(DI)區域的多態性。成功擴增88例惡性瘧原蟲分離株PfAMA1胞外段DI區域基因，與惡性瘧原蟲標準株3D7比較，檢測出31個分離位點，18個單倍型，單倍型多樣度為0.794。其中c1特別是c1L區域的基因多樣性顯著高于其他檢測區域。同時，分子進化分析顯示，DI區域及其中的c1和c1L區域在進化過程中經歷陽性選擇。研究發現，中緬邊境地區惡性瘧原蟲疫苗候選抗原PfAMA1基因DI區和其中c1、c1L區域高度多態，提示上述區域作為紅內期疫苗候選抗原研制靶位的可能性。

惡性瘧原蟲;PfAMA1;基因多態性;中緬邊境

KeywordsPlasmodium falciparum;PfAMA1;genetic polymorphism;China-Myanmar border

惡性瘧原蟲是可感染人類的五種瘧原蟲中致病性最為嚴重的瘧原蟲種屬，每年世界范圍內有43.8萬人死于惡性瘧感染，其中65%為5歲以下兒童［1］。抗藥原蟲株和耐藥蚊蟲的出現，使惡性瘧的防治面臨嚴峻的挑戰。安全有效的瘧疾疫苗研制是防治瘧疾的重要措施之一。然而，紅內期原蟲抗原多態性和瘧原蟲的免疫逃避機制阻礙了紅內期疫苗的研發進程。對紅內期疫苗候選抗原的基因多態性分析，是疫苗研制開發必備的前期基礎。惡性瘧原蟲株裂殖子頂端膜抗原1(PfAMA1)是惡性瘧主要的紅內期疫苗候選抗原，已進入II期臨床實驗［2］。PfAMA1基因編碼蛋白表達于裂殖子頂端復合體結構的微線體內，分泌到裂殖子表面與RON蛋白形成緊密連接復合體，在原蟲侵襲宿主紅細胞過程中發揮重要作用［3］。早期研究表明，PfAMA1基因的Domain I(DI)區域高度多態，在分子進化過程中經歷陽性選擇，為PfAMA1疫苗研制的主要靶位［4］。且DI區域中c1、c1L、c2和c3區域表達在PfAMA1蛋白表面。其中，c1L區域中197位氨基酸的突變與AMA1疫苗的特異性相關［5］。因此深入探討PfAMA1基因多態性將為瘧疾疫苗的研制提供參考。目前，尚未見關于中緬邊境地區惡性瘧原蟲發病阻斷疫苗候選抗原PfAMA1基因DI區域和其中的c1、c1L、c2和c3區域基因特點的報道。本研究通過對中緬邊境地區惡性瘧分離株PfAMA1基因的多態性特點和分子進化學進行分析，為我國惡性瘧紅內期疫苗的研制和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(德國);QIA-quick Gel Extraction Kit試劑盒(QIAGEN，加州，美國);ABI Prism BigDyeTM cycle sequencing kit (Applied Biosystems，加州，美國)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和基因組DNA提取2011年4月至2013年10月間，于緬甸西北部中緬邊境地區的瘧疾診所就診的患者中采集患者指尖血制備血樣干濾紙片。通過姬姆薩染色厚血膜法確認惡性瘧原蟲感染血樣。按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書提取惡性瘧原蟲基因組DNA。

1.2.2 PfAMA1基因Domain I區域的PCR擴增和測序采用PfAMA1基因Domain I(DI)區域的特異性PCR引物:Pfama1_nF(5'-GATGCTGAAGTAGCTGGAACTC-3')和Pfama1_nR(5'-CCCATAATCCGAATTTTGCATTCTG-3')擴增PfAMA1基因DI區(堿基位點(nucleotide position，nt)445～906 bp;氨基酸位點(amino acid position，aa)148～302)。PCR反應包含2 μL的10×KOD-Plus-Neo緩沖液，2 μL的2 mmol/L dNTPs，0.8 μL的25 mmol/L MgSO4，各0.5 μL的10 μmol/L引物，0.5單位的KOD-Plus-Neo DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)，1.0 μL基因組DNA模板，終體積20 μL。反應條件:94℃2 min;45個循環的94℃15 s，56℃15 s，68℃90 s;最終68℃延伸5 min。PCR產物經QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒提取純化。純化的PCR產物采用Pfama1_nF和Pfama1_nR引物，ABI Prism BigDyeTM cycle sequencing kit和ABI PRISM 310基因分析儀分析測序。

1.2.3 序列比對和基因多態性分析選用實驗室標準株3D7株作為參照，采用MEGA6.0軟件對比分析88個中緬邊境地區惡性瘧原蟲序列［6］。MEGA6.0軟件比對分析輸出的Fasta文件采用DnaSP v5.10.1軟件計算分離位點(the number of segregating sites，S)、平均核苷酸差異數(the average number of nucleotide differences，k)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型(the number of haplotypes，H)和單倍型多樣度(haplotype diversity，Hd)［7］。

1.2.4 分子進化分析采用DnaSP5.10.1軟件分析PfAMA1的DI區域的非同義核苷酸置換率dN和同義核苷酸置換率dS比值，Fu and Li’s D*and F*檢驗及Tajima’s D檢驗值和統計學差異。當Fu and Li’s D*and F*檢驗Tajima’s D檢驗值顯著大于0時，可用于推斷瓶頸效應和平衡選擇;當Fu and Li’s D*and F*檢驗Tajima’s D檢驗值顯著小于0時，可用于推斷群體規模放大和定向選擇［8］。采用Plasmodium reichenowi(GenBank nos.AJ252087)為瘧原蟲種間參考株［9］，通過Mc-Donald-Kreitman(MK)檢測，考查PfAMA1的DI區域在種內和種間的非同義與同義突變的比值。通過Fisher精準檢驗來驗證零假設，當檢驗值顯著大于0時，可用于推斷瓶頸效應和平衡選擇;當檢驗值顯著小于0時，可用于推斷群體規模放大和定向選擇［10］。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

本研究成功擴增了88例惡性瘧原蟲分離株PfAMA1基因的Domain I(DI)區域(nt:445～906 bp;149～302 aa)461 bp長度片段，包含c1(187～207 aa)、c1L(197～207 aa)、c2(242～245 aa和282～286 aa)和c3(172～175 aa)，見圖1。

2.2 基因多態性分析

88例樣本的PfAMA1基因DI區域和其中的c1、c1L、c2和c3區域核苷酸多樣性(π)分別為0.020、0.037、0.090、0.050/0.084和0.056;平均核苷酸差異數(k)在各檢測段分別為9.046、4.938、3.251、0.600/1.265和0.675。88例惡性瘧原蟲分離株PfAMA1基因DI分屬18個單倍型(H)，單倍型多樣度(Hd)為0.794，見表1。Sliding window plot分析結果顯示PfAMA1基因DI的c1區，特別是c1L的基因多態性明顯高于c2、c3和c4區，見圖2A。同時，c1特別是c1L區域氨基酸突變水平明顯高于其他檢測區域，見圖2B。

表1 中緬邊境地區88個惡性瘧原蟲分離株PfAMA1基因多態性分析Table 1Estimation of nucleotide diversity of PfAMA1 in 88 P.falciparum isolates from the China-Myanmar border area

2.3 分子進化分析

2.3.1 dN/dS比值分析DnaSP v5.10.1軟件分析結果顯示PfAMA1基因DI區和其中的c1和c1L區同義核苷酸置換率dS分別為0.001、0.005和0.022，非同義核苷酸置換率dN分別為0.003、0.045和0.111，dN/dS分別為18.299、9.125和4.982。同時，對PfAMA1基因DI區和其中的c1和c1L區的分析結果顯示，上述區域的非同義置換顯著高于同義置換，見表2。

圖1 P.falciparum和P.reichenowi AMA1蛋白序列比對Fig.1Alignment of P.falciparum and P.reichenowi AMA1 protein sequences各矩形框標記分別為c3、c1和c2區域;黃色背景所示為c1L區域;紅色加粗字體間所示區域為Domain I(DI);淺藍色字體標記為中緬邊境地區PfAMA1基因氨基酸多態性位點Black Boxes indicate c3，c1 and c2，respectively;The c1L region was highlighted by yellow color;Domain I(DI)was shown by red bold letters;The polymorphic sites of PfAMA1 from China-Myanmar border area were indicating by light blue color

圖2 中緬邊境樣本PfAMA1基因DI區基因多態性的sliding window plot和各位點氨基酸突變水平分析Fig.2Sliding window plot of nucleotide diversity and amino acid polymorphism analysis of PfAMA1 ectodomain in China-Myanmar border isolatesA:PfAMA1基因DI區基因多態性的sliding window plot圖;B:PfAMA1基因DI區各位點氨基酸突變數目統計圖，紅色區域所示為c1區A:Sliding window plot of nucleotide diversity of PfAMA1 DI:B:The amino acid polymorphism analysis of PfAMA1，The c1 region was indicates by red color

2.3.2 Fu and Li’s D*and F*檢驗對中緬邊境地區惡性瘧原蟲分離株PfAMA1的DI區和其中的c1和c1L區域的Fu and Li’s D*and F*檢測結果分別為1.941和2.104、1.618和1.915、1.426和1.644，見表2。其中，PfAMA1的DI區和其c1區域的Fu and Li’s D*and F*中性檢測結果拒絕零假設，因此，中緬邊境地區惡性瘧原蟲分離株PfAMA1基因的DI和其c1區在進化過程中偏離中性進化模型，經歷顯著的陽性選擇作用(P＜0.02和P＜0.001)，見圖3和表2。

2.3.3 McDonald-Kreitman(MK)檢驗基于種內多態性和種間分歧度之間數據比較的MK檢驗顯示，PfAMA1基因DI區的Fisher檢測結果拒絕零假設，在進化過程中經歷顯著的陽性選擇作用(P＜0.02)，見表2。

表2 中緬邊境地區88個惡性瘧原蟲分離株PfAMA1基因分子進化分析Table 2Estimation of summary statistics of PfAMA1 in 88 P.falciparum isolates from the China-Myanmar border area

圖3 中緬邊境樣本PfAMA1基因DI區Fu and Li’s D*and F*檢驗sliding window plot圖Fig.3Sliding window plots of Fu and Li’s D*and F*testA:Fu and Li’s D*檢驗;B:Fu and Li’s F*檢驗，直線以上區域所示P＜0.05A:Fu and Li’sD*test:B:Fu and Li’s F*test，Regions above lines shows P＜0.05

3 討論

2014年中國瘧疾病例為3 078例，境外輸入性瘧疾占98.1%，其中惡性瘧疾占61.1%［11］。由于邊境地區的人口流動，輸入性瘧疾疫情仍不容忽視。因此，本研究旨在通過對中緬邊境地區惡性瘧原蟲疫苗候選抗原PfAMA1基因的DI區域，和其內部蛋白表面表位區域的基因多態性和分子進化模式分析，為中緬邊境地區惡性瘧原蟲的防控提供理論依據。

近年研究發現，PfAMA1基因的DI和其內部表達于PfAMA1蛋白表面的c1、c1L、c2和c3區域與瘧原蟲抗原逃逸和感染后對宿主的致病性高度相關［12］。基因多態性分析顯示，PfAMA1基因的DI區域的31個分離位點中51.6%(16/31)定位于c1區域，其中68.8%(11/16)的分離位點集中于c1L區域。c1和c1L區域的平均核苷酸差異數(k)和核苷酸多樣性(π)顯著高于c2和c3區域。同時，DI區域中c1和c1L的單倍型數目亦明顯高于c2和c3區域，提示PfAMA1基因DI區域中c1和c1L區域高度多態，提示在進化過程中受宿主免疫系統選擇作用。采用PfAMA1單克隆抗體進行的發病阻斷疫苗研究顯示，PfAMA1蛋白的c1L和c1區域中197、200、201、204和225位點的氨基酸突變可阻斷單克隆抗體與PfAMA1蛋白的結合，從而抑制發病阻斷疫苗效果［13］。本研究發現，中緬邊境地區PfAMA1基因的c1和c1L區域在基因和蛋白水平高度多態，同時在197、200、201和225位點存在氨基酸多態性，提示上述區域在制備發病阻斷疫苗過程中可能影響疫苗免疫效果。

本研究選取DI區域中多態性水平較高的c1和c1L區域進行分子進化分析。DI區域和其中的c1和c1L區域的dN/dS比值均顯著大于1(P＜0.001)，提示上述區域在進化過程中經歷陽性選擇。同時，Fu and Li’s D*and F*檢驗結果顯示，DI區域和其中的c1和c1L區域的D*和F*檢驗值大于1，且DI和c1區域D*和F*值顯著大于1，提示DI和其c1區域在進化過程中經歷陽性選擇。采用Plasmodium reicheinow原蟲株作為種間對照進行的MK檢驗同樣證明DI區域在進化過程中經歷陽性選擇。上述結果提示PfAMA1基因的DI，特別是DI內的c1和c1L區域為宿主保護性免疫系統作用的靶位。

本研究首次檢測了中緬邊境惡性瘧原蟲流行地區PfAMA1基因DI區域，和其中位于PfAMA1蛋白表面的c1、c1L、c2和c3區域的基因多態性特點，并對DI區和其中的c1和c1L區域進行了分子進化分析，結果顯示，上述區域高度多態，且DI區和其內部c1和c1L區域在進化過程中經歷陽性選擇。本研究為我國邊境地區開發AMA1惡性瘧原蟲疫苗的研究和應用提供參考。

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Genetic Polymorphism Analysis of Plasmodium falciparum Apical Membrane Antigen I(PfAMA1)Domain I in China-Myanmar Border Area

FENG Yong-hui1，3，YU Xiao-fei2，CAO Ya-ming3，ZHU Xiao-tong3
(1.Dept.of Lab.Med.，1st Hosp.，China Med.Uni.，Shenyang 110001;2.Dept.of Neurol.，4th Affil.Hosp.，China Med.Uni.，Shenyang 110032;3.Teach＆Res.Div.Immunol.，Coll.of Basic Med.Sci.，China Med.Uni.，Shenyang 110122)

In order to confirm the genetic features of Plasmodium falciparum vaccine candidates PfAMA1 protein in China-Myanmar border area，88 blood samples from patients infected by P.falciparum in the border area were collected，and prepared filter paper sheets of blood samples，and extracted genomic DNA of P.falciparum with reagent kid; as well as PCR and sequence determination to analyse the polymorphism of Domain I(DI)of P.falciparum’s PfAMA1 gene.The DNA sequence of PfAMA1 gene of extracellular Domain I(DI)was amplified successfully by PCR and compared with standard 3D7 strain of P.falciparum and isolated 31 segregation sites，18 haploid types，with haploid diversity of 0.794.Among them the diversity in c1 especially c1L domains significantly higher than the other tested domains.At the same time，molecular evolution analyses showed that during the evolution process DI domain and of its c1 and c1L domains had experienced positive choice.The study has found that the candidate vaccine antigen PfAMA1 gene of DI domain and its c1 and c1L domains of P.falciparum in China-Myanmar border has high polymorphism，suggested that the above mentioned areas have the possibility to develop target of endoerythrocytic stage vaccine candidate antigen.

Q78;R382.3+1

A

1005－7021(2016)04－0036－05

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.006

國家自然科學青年基金項目(81301455)

馮永輝男，講師，博士。主要從事抗感染免疫研究。E-mail:Yonghuif@gmail.com

*通訊作者。女，副教授，博士，碩士生導師。主要從事抗感染免疫研究。E-mail:zhu.xt918@gmail.com

2016-02-23;

2016-04-04