南蛇藤提取物對過表達mTOR的人肝癌HepG2細胞株的影響＊

錢亞云，陸松花，趙雪煜，楊 婷，史有陽，金 鳳，劉延慶

（揚州大學醫學院 揚州 225009）

南蛇藤提取物對過表達mTOR的人肝癌HepG2細胞株的影響＊

錢亞云＊＊，陸松花，趙雪煜，楊 婷，史有陽，金 鳳，劉延慶

（揚州大學醫學院 揚州 225009）

目的：構建過表達雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）的人肝癌HepG2細胞，并研究中草藥南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.提取物對該細胞的影響。方法：利用分子生物學技術，將GV238-mTOR重組質粒轉染人肝癌HepG2細胞，分別用熒光素酶活性檢測和Western Blot實驗，分析轉染后的細胞中mTOR的表達水平。人肝癌HepG2/mTOR++細胞中，加入不同濃度的南蛇藤提取物（20、40、80、160、320 μg·mL-1）作用24 h后，分析南蛇藤提取物對mTOR蛋白的作用。結果：經轉染的人肝癌HepG2細胞中，mTOR蛋白的表達水平顯著增加。南蛇藤提取物明顯抑制肝癌細胞的增殖，并明顯降低細胞內mTOR蛋白的表達。結論：本實驗成功獲得能穩定過表達mTOR的人肝癌HepG2細胞株。南蛇藤提取物明顯抑制肝癌細胞內mTOR蛋白的表達水平。

南蛇藤 肝癌 過表達 雷帕霉素靶蛋白

哺乳動物mTOR也稱雷帕霉素相關蛋白（Rapamycin-Associated Protein, FKBP），是磷脂酰肌醇激酶相關激酶蛋白家族成員，屬非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究發現mTOR參與體內多條信號通路的調節，在細胞的增殖、分化、自噬等環節具有中心調控作用[1]。臨床肝癌手術標本中mTOR的表達量與肝癌的惡性程度及不良轉歸呈正相關[2]。這些結果提示mTOR可能是藥物治療肝癌的潛在靶點之一。為了研究mTOR在肝癌中的作用，本課題組構建了能穩定過表達mTOR的人肝癌HepG2細胞，并研究了中草藥南蛇藤提取物對該細胞株的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人肝癌細胞株HepG2，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。帶有熒光素酶報告基因的載體GV238（元件順序MCS-Luc），本實驗室自備。限制性內切酶MluI和BglII、T4 DNA Ligation Kit購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。梭華-Sofast基因轉染盒購自廈門太陽馬生物工程有限公司。

1.2 藥物

南蛇藤提取物提取方法如前所述[5,6]，現簡述如下。南蛇藤購自廣州致信藥業有限公司，經中國藥科大學中藥資源研究室秦民堅教授鑒定為衛矛科南蛇藤屬植物。將南蛇藤莖切斷、粉碎成粉，烘干（15 kg），用95%乙醇（150 L）提取3 h，重復3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏（900 g）加水分散后，石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層，水洗滌3次，減壓濃縮，真空凍干，得南蛇藤莖乙酸乙酯提取物（250 g），貯存于4℃。每1 g提取物相當于60 g生藥，使用前以DMSO助溶。

1.3 RT-PCR檢測mTOR mRNA表達

按GeneBank中mTOR（NM_004958）啟動子的序列設計引物。上游引物P1：5’-ATCGACGCG TACTTACATTGTTGCACAACTTG-3’；下游引物P2：5’-CCGAAGATCTCTTCGGCCAAGGCCTCAGCT GC-3’，引物中包含交換配對堿基、酶切位點以及目的基因中5’端部分調取基因。RT-PCR擴增目的基因片段，20 μL總反應體系，反應參數設為：94℃5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環后72℃ 10 min。PCR鑒定陽性克隆，上游引物P3：5’-CGGCATCGCTCACATTCT-3’；下游引物P4：5’-TGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3’，20 μL總反應體系，設定程序94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 40 s，30個循環后72℃ 5 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 過表達mTOR載體的構建

載體GV238和含有mTOR啟動子的PCR產物，分別以限制性內切酶MluI和BglII雙酶切，連接兩種純化后的酶切產物，轉化E.coli DH5α感受態，挑克隆，雙酶切和PCR方法初步篩選并進行DNA序列測定。

1.5 質粒轉染及熒光素酶活性檢測

對數期HepG2細胞（約4×105），接種于24孔板，培養至細胞融合度為80%。嚴格按轉染試劑盒要求，進行質粒轉染及熒光素酶活性檢測。步驟簡述如下，將轉染緩沖液按比例加入質粒中（2 μL緩沖液：0.6 μg質粒），室溫靜置20 min后，將該混合液加入HepG2細胞中，于孵箱中培養48 h，室溫下加入裂解液反應10 min，終止反應，酶標儀檢測熒光素酶相對熒光值，進行數據收集和分析。

1.6 Western Blot檢測蛋白表達水平

質粒轉染后的HepG2細胞，培養至對數生長期，提取總蛋白，以改良型Lowry 法測定蛋白樣品濃度。所得蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，加入一抗（1：1 000），4℃過夜，再加二抗（1：4 000）室溫孵育2 h，ECL顯影，進行圖像采集并分析。

1.7 MTT試驗

取96孔板，收集對數期HepG2/mTOR++細胞，調整濃度為103-104個/孔，以無血清培養基孵育12 h后，棄上清。加入不同濃度（20、40、80、160或320 μg·mL-1）的COE（以無血清培養基配置），陽性藥物為2 μg·mL-1的DDP。每種濃度設5個復孔。以含2%FBS的RPMI 1640維持培養基孵育16-48 h。每孔加入20 μL MTT溶液（5 μg·mL-1，即0.5% MTT），繼續培養4 h。終止培養，棄去培養上清。每孔加入DMSO 150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。同時設置調零孔和對照孔。酶聯免疫檢測儀于OD 490 nm處測量各孔吸光值。

1.8 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件處理，計量數據以均數± 標準差表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組載體的構建及鑒定

利用PCR技術，擴增出長約2 114 bp的mTOR啟動子區的片段（圖1）。將PCR產物及GV238載體分別用MluI和BglII進行雙酶切，酶切產物純化后用T4 DNA連接酶連接，轉化E.coli DH5α感受態，挑取重組體用PCR和雙酶切反應進行初步鑒定，獲得大小合適的片段（約為562 bp，圖2），表明獲得GV238 - mTOR重組質粒。

圖1 mTOR啟動子PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組克隆PCR鑒定產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 WB檢測mTOR蛋白表達水平

圖4 熒光素酶相對活性檢測

2.2 重組載體的測序

接種陽性轉化子，37℃培養16 h后保存為甘油菌，分裝200 μL，雙向測序，經NCBI-BLAST比對分析，mTOR啟動子基因序列與GeneBank登錄的mTOR（NM_004958）序列完全同源性高達99%，表明已成功構建GV238-mTOR重組子。

2.3 Western Blot檢測mTOR蛋白表達水平

收集轉染GV238-mTOR重組質粒的人肝癌HepG2細胞，提取總蛋白，Western Blot檢測mTOR蛋白的表達水平。結果如圖3所示，與野生型人肝癌HepG2細胞相比，轉染GV238-mTOR重組質粒的人肝癌HepG2（記作HepG2 / mTOR++細胞）中，mTOR蛋白的表達水平明顯增加。

2.4 熒光素酶相對活性檢測

將GV238空載體質粒和GV238-mTOR重組質粒分別轉染人肝癌HepG2細胞，24 h后檢測細胞內熒光素酶的相對熒光強度。實驗結果如圖4所示，與轉染GV238空載體質粒的陰性對照相比，轉染GV238-mTOR重組質粒的熒光強度明顯增強（P＜0.01），表明成功構建高表達mTOR的人肝癌HepG2細胞株。

2.5 南蛇藤提取物對HepG2/mTOR++細胞株的影響

以MTT試驗分析南蛇藤提取物對HepG2/ mTOR++細胞增殖能力的影響。結果如圖5所示，與未加藥組相比，藥物作用24 h，南蛇藤提取物明顯抑制HepG2/mTOR++肝癌細胞的增殖（P＜0.05），并具有時間濃度依賴性。同時，計算南蛇藤提取物IC50約136.13 μg·mL-1。

2.6 南蛇藤提取物對mTOR蛋白的影響

將HepG2/mTOR++細胞培養至對數期，加入不同濃度的南蛇藤提取物，并以mTOR蛋白的抑制劑Rapamycin作為陽性對照藥物，Western Blot檢測細胞內mTOR蛋白表達水平。結果如圖6所示，南蛇藤提取物明顯抑制細胞內mTOR蛋白的表達。

3 討論

目前，干擾細胞內蛋白表達的技術主要有腺病毒感染[3]、質粒轉染、轉錄激活樣效應物核酸酶（TALEN）基因敲除[4]等，需要根據目的蛋白的分子量大小和特性選擇合適的方法。mTOR蛋白分子量大（289 kDa），不易包裝成腺病毒，因此，本實驗室選擇運用質粒轉染技術構建過表達的人肝癌HepG2細胞株。腫瘤細胞中mTOR分子大量表達，可誘導酪氨酸激酶磷酸化，活化下游src、PI3K/Akt、MAPK等信號通路，激活EMT[7]，增強腫瘤細胞的侵襲轉移能力。也有研究者發現，PI3K/Akt/mTOR的異常激活，也與腫瘤干細胞的表型[8]密切相關。因此，研究mTOR信號通路可以進一步認識機體的各種生理功能，為腫瘤的治療提供新思路。

圖5 南蛇藤提取物對HepG2/mTOR++細胞增殖能力的影響

圖6 WB檢測mTOR蛋白表達水平

很多中草藥提取物具有多靶點抗腫瘤[9,10]作用，并且副作用較小。南蛇藤在中國分布甚廣，藥用價值始載于清代《植物名實圖考》。本課題組前期研究發現，南蛇藤提取物不僅能抑制肝癌的生長和血管生成，促進樹突狀細胞的成熟，增強CD8+T細胞特異性抗腫瘤的細胞免疫功能；而且能在一定程度上逆轉人肝癌細胞上皮間質轉化[5]（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）過程。初步分析南蛇藤提取物抗癌的分子機制，可能與mTOR[6]信號通路相關。為了探討南蛇藤提取物能否抑制肝癌細胞中mTOR的表達，本研究構建了HepG2/mTOR++細胞株，并發現南蛇藤提取物呈濃度依賴性地抑制人肝癌HepG2細胞的增殖，降低mTOR的表達水平。但南蛇藤提取物是否通過靶向mTOR逆轉EMT，還需要分析藥物作用與EMT標記蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）的表達水平之間的相關性。另外，還需要建立用RNAi沉默表達mTOR的HepG2肝癌細胞模型，以不同濃度的南蛇藤總萜干預，系統研究南蛇藤總萜靶向mTOR通路抑制肝癌細胞EMT的分子機制。同時，課題組還會建立原位/尾靜脈接種的肝癌裸鼠模型，通過分子示蹤技術，動態觀察南蛇藤總萜對肝癌移植瘤生長以及轉移能力的影響。

下一步研究，擬對南蛇藤提取物通過靶向mTOR抑制肝癌EMT的具體分子信號通路，進行更深入的探討。

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3 Prelich G. Gene overexpression: uses, mechanisms, and interpretation. Genetics, 2012, 190(3)：841-854.

4 張文美,丁妍,郭興榮,等. TALEN介導的CXCR4敲除肝癌細胞株的建立.生物技術通報,2016,32(2)：225-228.

5 錢亞云,曹玲,劉延慶,等.南蛇藤提取物增強抑癌基因Maspin抑制人胃癌細胞株MGC803侵襲能力的研究.世界科學技術-中醫藥現代化,2014,16(11)：2470-2474.

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10 王俊,尹萌,韓東冬,等.銀杏外種皮提取物重金屬元素與銀杏酸測定.世界科學技術-中醫藥現代化,2016,18(1)：65-68.

Effects of Celastrus orbiculatus Thunb. Extract on the Overexpression of mTOR in Human HepG2 Cells

Qian Yayun, Lu Songhua, Zhao Xueyu, Yang Ting, Shi Youyang, Jin Feng, Liu Yanqing
(Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225003, China)

This study aimed at investigating the effects of the extract of Chinese herb, Nansheteng (C. orbiculatus Thunb.), on human HepG2 cells through the overexpression of mTOR. The GV238-mTOR recombinant plasmids were transfected into HepG2 cells using molecular biological technology. The expression level of mTOR was evaluated by means of relative activity of luciferase and western blot. Human hepatic carcinoma HepG2/mTOR++cells were treated with C. orbiculatus extract in different concentrations (20, 40, 80, 160 and 320 μg·mL-1) for 24 h. The mTOR protein expression was detected by western blot. It was found that the protein expression of mTOR in transfected HepG2 cells was significantly enhanced. C. orbiculatus extract significantly inhibited the proliferation of HepG2/mTOR++cells. Simultaneously, C. orbiculatus extract inhibited mTOR at its protein level in a dose-dependent manner. In conclusion, we successfully constructed recombinant mTOR cloning vectors, and established the stable HepG2 cell line with the overexpression of mTOR. Besides, C. orbiculatus extract significantly inhibited mTOR protein expression in human hepatic carcinoma HepG2 cells.

Celastrus orbiculatus Thunb., hepatic carcinoma, overexpression, mammalian target of rapamycin

10.11842/wst.2016.12.018

R285.5

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-10-17

修回日期：2016-11-29

＊ 國家自然科學基金委青年基金項目（81403232）：南蛇藤提取物靶向PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制肝癌早期轉移的作用及機制研究，負責人：錢亞云；國家自然科學基金委面上項目（81274141）：南蛇藤總萜通過協同抑制Notch和VEGF的表達阻斷肝癌血管生成的作用機制，負責人：劉延慶；江蘇省自然科學基金委面上項目（BK2012686）：南蛇藤提取物增強抑癌基因MASPIN表達抑制胃癌轉移的機制研究，負責人：錢亞云；教育部博士點基金新教師類項目（20133250120003）：南蛇藤總萜靶向mTOR信號通路抑制肝癌轉移的分子機制研究，負責人：錢亞云。

＊＊ 通訊作者：錢亞云，副教授，碩士生導師，博士，主要研究方向：中西醫結合抗腫瘤研究。