UPLC-ESI-QTOF-MS檢測巴西龜龜甲膠中牛皮特征肽的研究＊

唐 敏，嚴建業，2，趙小芳，徐 博，王學生，李順祥，2＊＊

（1. 湖南中醫藥大學藥學院 長沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心長沙 410208；3.山東一笑堂阿膠集團百年制藥有限公司 新蔡 463500）

UPLC-ESI-QTOF-MS檢測巴西龜龜甲膠中牛皮特征肽的研究＊

唐 敏1，嚴建業1，2，趙小芳1，徐 博1，王學生3，李順祥1，2＊＊

（1. 湖南中醫藥大學藥學院 長沙 410208；2. 湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心長沙 410208；3.山東一笑堂阿膠集團百年制藥有限公司 新蔡 463500）

目的：以巴西龜為來源的龜甲膠中牛皮特征肽成分的檢測。方法：采用胰蛋白酶進行酶解，利用超高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質譜法分別對以巴西龜為來源的龜甲膠和以中華草龜為來源的龜甲膠進行測定，選定牛皮特征肽離子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8作為檢測對象。結果：巴西龜來源的龜甲膠中只檢測出牛皮特征肽離子m/z 641.3信號，其MS/MS裂解規律與黃明膠標準品酶解產物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR一致，而中華草龜來源的龜甲膠中均未檢測出牛皮特征肽信號。結論：該方法專屬性強，靈敏度高，可區別巴西龜龜甲膠和摻雜牛皮成分的龜甲膠，可用于龜甲膠的質量控制。

超高效液相色譜-電噴霧串聯四極桿飛行時間質譜 牛皮特征肽 巴西龜龜甲 龜甲膠

龜甲膠是龜科動物烏龜的背甲及腹甲經水煎煮、濃縮制成的固體膠，歷版《中國藥典》均有收載，是中國名貴中藥[1]，其味甘、咸，性平，歸肝、腎經，可滋陰，補血，主治陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃等癥。中華草龜龜甲入藥在中國已有數千年歷史，近年來由于其價格昂貴，草龜被過度捕殺，造成其資源面臨嚴重匱乏。一些廠家為了節省成本，利用其它動物甲殼和皮革為原料來生產龜甲膠，其中包括以巴西龜龜殼和摻雜牛皮為原料的情況。巴西龜（Trachemys scripta elegans）又名紅耳龜[2]，原產于美洲，因其適應性強、食性廣且生長繁殖迅速、大量掠奪同類物種的生存資源，而被列為世界上最危險的入侵物種之一[3]。巴西龜對生態具有一定的破壞性，但資源極其豐富，價格也相對低廉。在中國，巴西龜于20世紀80年代經香港被引入內陸[4]，其養殖遍及中國中南部的所有省區，相關貿易則遍布全國所有省份[5]。根據市場調查統計結果[6]，巴西龜龜甲的市場占有率高達38%，僅次于中華草龜。實際檢測中發現，巴西龜龜甲膠與中華草龜龜甲膠酶解產物中龜甲特征肽的含量相差不大。同時，也有報道顯示巴西龜龜甲膠同樣具有較好的滋陰作用[7，8]，有學者推測巴西龜有可能部分替代藥典草龜成為制備龜甲膠的原料。

膠類藥材是指由動物的皮革、骨骼等加工而成的膠原蛋白水解肽[9]。根據不同動物的同類型膠原蛋白的氨基酸序列存在差異[10]，其胰蛋白酶水解產物所含肽段之間即存在差異性。近年來，利用LC-MS技術對不同膠類酶解產物的特征肽段進行分析的方法日趨成熟[11，12]，而被廣泛用于膠類制劑的檢測。以牛皮為原料熬制的膠類稱之為黃明膠，據相關文獻報道[13-15]，黃明膠經過胰蛋白酶水解后產生的多肽離子中，m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8具有特征性。2015版《中國藥典》標準規定了采用HPLC-MS對龜甲特征肽進行定性檢測，但未對其他摻雜膠類予以說明。國家食品藥品監督管理總局（CFDA）已出臺的補充檢測方法批件（批件號：2014013）對龜甲膠中是否摻雜牛皮成分有所要求，該方法采用HPLC-MS聯用技術對龜甲膠樣品酶解產物中的牛皮特征肽離子m/z 641.3進行定性和定量檢測。但是，在實際檢測工作中發現，以巴西龜為原料的龜甲膠樣品中可檢測出牛皮特征肽離子m/z 641.3的信號[16]。鑒于巴西龜龜甲膠酶解產物和摻雜黃明膠的龜甲膠酶解產物中均可檢測出牛皮特征肽離子m/z 641.3的信號，現行的標準不能很好區別以上兩者。因此，為了區別巴西龜龜甲膠和摻雜牛皮成分的龜甲膠，對除m/z 641.3以外的其他牛皮特征肽離子進行檢測顯得尤為必要。

1 儀器與試藥

Waters Acquity超高效液相系統（美國Waters公司）；Waters-Xevo-G2-QTOF質譜系統（美國Waters公司）；ACQUITY UPLC-BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters公司）。Mettler MS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler公司）；KQ 5200型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；ELGA PURELAB OPTION-R 7超純水儀（英國ELGA公司）。

亮氨酸腦啡肽（美國Waters公司，批號：700008842-1）；甲 酸（德 國CNW公 司，批 號：N030K060）、乙腈（色譜純，德國Merck公司，批號：1746030430）；序列分析級胰蛋白酶（美國Promega公司，批號：00001714876）；NH4HCO3（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150119）；龜甲膠對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121693-201301）；黃明膠對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121695-201301）。

本實驗所用龜甲膠樣品均為實驗室按照相關膠類藥材的生產工藝自行制得，樣品共計4份，其原料分別是干巴西龜龜殼、活巴西龜龜殼、干草龜龜殼、活草龜龜殼。

表1 不同原料龜甲膠供試品牛皮特征肽成分的檢測結果

2 方法與結果

2.1 液相條件

流動相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脫（0-25 min，5% B→20% B；25-40 min，20%B→50%B；40-41 min，50%B→ 99% B；41-42 min，99% B；42-43 min，99%B→5%B；43-45 min，5%B）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40℃；進樣量為1 μL。

2.2 質譜條件

離子化模式為ESI+，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為40 V，除溶劑溫度為450℃，除溶劑氣體為600 L·h-1。離子源溫度為120℃。采用MSE和MS/ MS方式進行數據采集，采集時間為45 min，掃描范圍為100-1 500 amu，掃描時間為0.2 s。錐孔電壓40 V。碰撞能量：MSE方式低能量為4 V，梯度高能量為20-30 V；MS/MS方式碰撞能量為25 V。碰撞氣體為高純氬氣。

2.3 供試品溶液制備

在選擇酶解時間方面，本研究考察的酶解時間為12、16、18 h，因各組試驗結果差異不大，故最終選定酶解時間為12 h。

分別稱取原料為干巴西龜龜甲、活巴西龜龜甲、干草龜龜甲、活草龜龜甲的龜甲膠樣品各0.1 g，分別置于50 mL量瓶中，加1% NH4HCO3溶液超聲溶解并稀釋至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜，取連續濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析純胰蛋白酶適量，加1%NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，制得供試品溶液1、2、3、4。

2.4 對照品溶液制備

分別稱取龜甲膠標準品和黃明膠標準品各0.1 g，分別置于50 mL量瓶中加1% NH4HCO3溶液超聲溶解并稀釋至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜，取連續濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析純胰蛋白酶適量，加1% NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，制得對照品溶液5、6。

2.5 牛皮元特征峰的確認

黃明膠標準品酶解溶液中可檢測出牛皮特征肽離子m/z 604.8、m/z 641.3、m/z 790.8，巴西龜龜甲膠樣品酶解溶液中可檢測到牛皮特征肽離子m/z 641.3，檢測結果見表1，質譜提取離子峰見圖1。根據檢測結果，中華草龜龜甲膠樣品酶解溶液中未檢測到牛皮特征肽離子。并對巴西龜龜甲膠酶解溶液中檢測到的牛皮特征肽離子m/z 641.3進行二級質譜分析，得出其MS/MS裂解規律與黃明膠標準品酶解產物所含牛皮特征肽GEAGPSGPAGPTGAR完全一致[17]，相關質譜裂解數據見圖2。

2.6 精密度考察

取干巴西龜龜甲膠制得的供試品溶液，以m/z 604.8和m/z 790. 8共2個牛皮特征肽提取離子峰作為檢測檢測對象，連續測定6次，結果的RSD分別為1.37%和1.95%（n=6），表明本方法精密度良好。

圖1 巴西龜龜甲膠、黃明膠牛皮特征肽提取離子峰

2.7 穩定性考察

取干巴西龜龜甲膠制得的供試品溶液，以m/z 790.8和m/z 604.8共2個牛皮特征肽提取離子峰作為檢測對象，分別于0、2、4、6、8、10 h測定，結果2個特征峰均可被檢出，平均保留時間分別為5.17 min和13.10 min，RSD為1.35%和1.40%，說明供試品溶液在10 h內均可滿足穩定性需要。

圖2 巴西龜龜甲膠和黃明膠標準品酶解產物m/z 641.3 MS/MS裂解質譜圖

3 討論

《中國藥典》收錄的龜甲膠來源為中華草龜，但因其資源面臨枯竭，勢必需要尋找其它代用品。巴西龜生命力頑強而又極易飼養，推測其有可能部分替代藥典草龜成為生產龜甲膠的原料。現行的龜甲膠檢測補充批件規定，原材料是否摻雜牛皮的檢測指標為牛皮特征肽離子m/z 641.3。根據本研究對巴西龜龜甲膠酶解樣品中檢測到的m/z 641.3離子進行了二級質譜裂解分析，其裂解規律與黃明膠標準品酶解產物所含牛皮特征肽（GEAGPSGPAGPTGAR）一致[17]，故巴西龜龜甲膠酶解產物中也可檢測出該特征肽信號。如果巴西龜可作為中華草龜的替代品來制備龜甲膠，那么現行的檢測方法就不能很好區別巴西龜龜甲膠和摻雜黃明膠的龜甲膠。根據本課題組的檢測結果，黃明膠酶解產物中已發現的另外兩個牛皮特征肽離子m/z 604.8和m/z 790.8，在巴西龜龜甲膠酶解產物檢測不到。因此，本研究建議利用m/z 604.8和m/z 790.8兩個特征肽離子為檢測指標，該方法可以很好地區別巴西龜龜甲膠和摻雜黃明膠的龜甲膠。

參考文獻

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Identification of Bovine Hide Gelatine from the Shell Glue of the Red-Eared Slider (Trachemys scripta elegans) Using UPLC-ESI-QTOF-MS

Tang Min1, Yan Jianye1,2, Zhao Xiaofang1, Xu Bo1, Wang Xuesheng3, Li Shunxiang1,2
(1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Hunan Province Engineering Research Center of Bioactive Substance Discovery of Traditional Chinese Medicine, Changsha, 410208, China; 3. SHANDONG YIXIAOTANG EJIAO GROUP BAINIAN ZHIYAO CO,.LTD, Xincai 463500, China)

This study aimed at developing an ultra-performance liquid chromatography electrospray time of flight-mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF-MS) method for the identification of bovine hide gelatine from the shell glue of the red-eared slider. Tortoise shell glue was made from the shell of red-eared slider or Reeves' turtle (Chinemys reevesii). The samples were analyzed on UPLC-ESI-QTOF-MS after being digested by trypsin, and the ions at m/z 604.8, m/z 641.3, m/z 790.8 of the marker peptides of bovine hide gelatin were detected. As a result, it was found that the test results of the ions made from the shell of red-eared slider at m/z 641.3 were positive, taking the same fragmentation regularity of MS/MS as the standard of bovine-hide gelatine, while negative results were detected from the ions made from the shell of Reeves' turtle. In conclusion, the method was simple and accurate provided a basis for distinguishing the tortoise shell glue from bovine hide, which could be also used for the quality control of tortoise shell glue.

Ultra-performance liquid chromatography electrospray time of flight-mass spectrometry, the marker peptides of bovine hide gelatine, the shell of Trachemys scripta elegans, tortoise shell glue

10.11842/wst.2016.12.024

R284

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-13

修回日期：2016-12-10

＊ 國家中醫藥管理局“藥用植物學”重點學科課題（國中醫藥發[2009]30號），負責人：李順祥；湖南省教育廳“中藥學”重點學科（湘教通[2011]76號），負責人：李順祥；湖南省教育廳高校科技創新團隊（湘教通[2010]212號），負責人：李順祥。

＊＊ 通訊作者：李順祥，本刊編委，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥成分與資源研究。