ING4、PHDs在低氧性肺動脈高壓大鼠中的表達及意義分析

孫永彪朱 佳蘇宗義李 麗張忠雙▲

1.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2.新疆維吾爾自治區人民醫院呼吸科，新疆烏魯木齊830000；3.解放軍駐石河子大學選培辦，新疆石河子 832000；4.石河子大學醫學院基礎醫學系，新疆石河子 832000

ING4、PHDs在低氧性肺動脈高壓大鼠中的表達及意義分析

孫永彪1△朱 佳2蘇宗義3李 麗4張忠雙4▲

1.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2.新疆維吾爾自治區人民醫院呼吸科，新疆烏魯木齊830000；3.解放軍駐石河子大學選培辦，新疆石河子 832000；4.石河子大學醫學院基礎醫學系，新疆石河子 832000

目的對低氧性肺動脈高壓大鼠（HPH）中的ING4和PHDs的表達水平及其意義進行探討。方法利用低氧性肺動脈高壓大鼠模型，檢測不同缺氧時間點上的大鼠右心室肥大指數（RVHI）、平均肺動脈壓（mPAP）以及觀察肺小動脈重塑（HPVR）。采用RT-PCR和Western blot檢測ING4、PHDs以及HIF-1α的mRNA表達水平及蛋白表達水平。結果結果顯示，從缺氧第7天開始實驗組大鼠的mPAP顯著高于空白對照組（P＜0.05），且第14天達到最高值，且大鼠的RVHI也開始增加，且已形成右心室肥厚和官腔狹窄。在mRNA水平上ING4、PHD2以及PHD3的表達在缺氧第3天開始顯著增高（P＜0.05），且HIF-1α在起初無顯著變化直到第14天才開始增高（P＜0.05），而PHD1的mRNA表達水平在缺氧后與空白對照組相比，無顯著差異（P＞0.05）；在蛋白水平上ING4的蛋白表達水平在缺氧第7天時表達顯著增高（P＜0.05），PHD2、PHD3以及HIF-1α的蛋白表達水平在缺氧第3天開始增高（P＜0.05），而PHD1的蛋白表達水平在缺氧起初無顯著變化，直到第14天時，與空白對照組比較，有顯著降低，且隨后一直維持較低水平（P＜0.05）。結論在低氧性肺動脈高壓大鼠中ING4和PHDs的表達變化會影響低氧性肺動脈高壓的產生和發展。

ING4；PHDs；低氧性肺動脈高壓；大鼠

慢性肺源性心臟病為一種臨床上常見的肺心病，嚴重危害著患者的健康和生命，其中85%的慢性肺源性心臟病均是由慢性阻塞性肺部疾病（COPD）發展而來的。肺動脈高壓是引起慢性肺源性心臟病的根本原因，且缺氧是引起肺動脈高壓的關鍵因素，因此研究缺氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）的發病機制是治療慢性肺源性心臟病的關鍵措施[1]。有研究表明，肺動脈平滑肌細胞的凋亡和增殖失衡是低氧性肺血管重塑發生發展的重要細胞機制，而低氧誘導因子-1（HIF-1）是導致此平衡失衡的關鍵分子[2-3]。還有研究表明，氧感受器-HIF脯氨酰羥化酶（PHDs）是HIF-1α氧依賴性降解的限速酶，也是催化特定脯氨酸殘基羥基化的關鍵[4]。最新發現的一種候補腫瘤抑制蛋白ING4具有與PHD蛋白家族類似的結構，也能參與腫瘤形成和細胞凋亡DNA修復以及細胞周期控制等多種反應過程[5]。本研究利用低氧性肺動脈高壓大鼠模型，對低氧性肺動脈高壓大鼠中的ING4、PHDs以及HIF-1α的表達水平及其意義進行了探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

Wistar大鼠選用體重（250±30）g，10周齡，雌性，購自新疆醫科大學動物中心（許可證編號SCXK新2003-0001），動物質量符合一級標準。RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，兔抗人ING4、PHDs、HIF-1α抗體及GAPDH抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組 按體重大小，將大鼠平均分成5組，每組含有10只大鼠，分別為H3（缺氧3d）、H7（缺氧7d）、H14（缺氧14d）、H21（缺氧21d）以及空白對照組。各實驗組，每天均進行8h間斷缺氧，而對照組則正常氧氣供應，其他飼養條件均相同。

1.2.2 肺動脈壓測定 首先以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，然后通過壓力傳感器連接Powerlab（美國匹茲堡 AD器械有限公司）進行壓力測定，進而計算大鼠的平均肺動脈壓力（mPAP）。

1.2.3 右室肥厚指數測定 將測完mPAP的大鼠在麻醉狀態下處死，剖開胸腔取出心臟，在4%甲醛中固定2d。沿房室溝切除心房及大血管根部，再沿到后室間溝將右心室游離壁分離，吸干水分后分別稱取右室（RV）和左室＋室間隔（LV＋S）的重量，以計算右室肥厚指數（RVHI），該指數反應右心室肥厚變化[6]。

1.2.4 肺小血管形態觀察 取大鼠肺部做石蠟切片，每只大鼠選取三張切片，每張切片均含有直徑100μm左右的非小動脈五支，隨后采用朗珈PAS9000病理圖像分析軟件進行肺動脈管壁面積/管總面積（WA%）以及管腔面積/管總面積（LA%）的測定。這些測定結果可作為肺小血管重塑指標。

1.2.5 ING4、PHDs以 及HIF-1α 免 疫 組 化 檢測 經切片與烤片、脫蠟置水以及抗原微波修復后，用3% H2O2清除內源性過氧化物酶，室溫放置10min，用PBS清洗3遍后，封閉15min。隨后滴加一抗和二抗，DAB/SABC顯色，蘇木素復染后經酒精梯度脫水，透明，封片，光鏡觀察。每張切片隨機選取5個視野進行拍照。

1.2.6 RT-PCR方法檢測ING4、PHDs以及HIF-1α的mRNA水平 采集小鼠肺動脈并用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，再將提取的RNA反轉錄成cDNA，并在-20℃保存備用。使用Primer5.0軟件設計引物（表1）。隨后進行電泳檢測，并利用凝膠圖像分析儀對條帶進行半定量后計算檢測條帶的吸光度和GAPDH的吸光度比值。

表1 引物

1.2.7 western blot方 法 檢 測 ING4、PHDs以及HIF-1α的表達水平 采集小鼠肺動脈，并用RIRA裂解液裂解細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白，隨后進行SD-PAGE，再經轉膜后，用脫脂乳封閉1h，隨后加入兔抗人ING4、PHDs、HIF-1α以及GAPDH抗體，洗膜后再加入二抗孵育1h，隨后采用ECL顯色，最后用凝膠成像儀拍照觀察。

1.3 統計學方法

所得數據均使用SPSS19.0進行統計分析。以t檢驗來表示組間計量資料對比，正態計量資料以（）表示，用P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同缺氧時間對低氧性肺動脈高壓大鼠模型平均肺動脈壓力（mPAP）、右心室肥厚（RVHI）及肺血管重塑的影響

研究結果顯示，從缺氧第7天開始實驗組大鼠的mPAP顯著高于空白對照組（P＜0.05），且第14天達到最高值，隨后直到21天仍處于較高水平；從缺氧第14天開始實驗組大鼠的RVHI顯著高于空白對照組（P＜0.05），且已形成右心室肥厚；缺氧第7天就可觀察到直徑100μm的肺小動脈中層平滑肌的增生、管壁增厚以及管腔狹窄，直到第14天平滑肌增生開始顯著，管腔進一步狹窄（P＜0.05）。見表2。

表2 平均肺動脈壓力（mPAP）、右心室肥厚（RVHI）及肺血管重塑的指標

表3 ING4、PHDs以及HIF-1α的mRNA表達水平

2.2 免疫組化結果

研究結果顯示，ING4的表達在缺氧第7天時表達顯著增高，在缺氧第14天達到了最高峰（P＜0.05）。PHD1的表達在缺氧起初無顯著變化，直到第14天時，與空白對照組比較，有顯著降低，且隨后一直維持較低水平；PHD2的表達在缺氧第3天開始增高，在缺氧第14天達到最高點，隨后一直保持較高水平；PHD3的表達在缺氧第3天開始增高，隨之一直保持較高水平，直到缺氧第14天開始有所下降，但均高于空白對照組（P＜0.05）。HIF-1α的表達在缺氧第3天開始增高，在缺氧第7天達到最高點，隨后有所下降（P＜0.05）。

2.3 ING4、PHDs以及HIF-1α的mRNA表達水平

研究結果顯示，ING4的mRNA表達水平在缺氧第3天后開始增高，缺氧第7天可達到最高峰，隨后有所下降，但均高于空白對照組（P＜0.05）。PHD1的mRNA表達水平在缺氧后與空白對照組相比，無顯著差異；PHD2的mRNA表達水平在缺氧第3天開始增高，在缺氧第14天達到最高點，隨后一直保持較高水平；PHD3的mRNA表達水平與PHD2的mRNA表達水平的趨勢相一致（P＜0.05）。HIF-1α的mRNA表達水平在缺氧第3天和第7天無顯著變化，而在缺氧第14天開始增高，且顯著高于空白對照組（P＜0.05）。見表3。

2.4 ING4、PHDs以及HIF-1α的蛋白表達水平

研究結果顯示，ING4的蛋白表達水平在缺氧第7天時表達顯著增高，在缺氧第14天達到了最高峰（P＜0.05）。PHD1的蛋白表達水平在缺氧起初無顯著變化，直到第第14天時，與空白對照組比較，有顯著降低，且隨后一直維持較低水平；PHD2的蛋白表達水平在缺氧第3天開始增高，在缺氧第14天達到最高點，隨后一直保持較高水平；PHD3的蛋白表達水平在缺氧第3天開始增高，隨之一直保持較高水平，直到缺氧第14天開始有所下降，但均高于空白對照組（P＜0.05）。HIF-1α的蛋白表達水平在缺氧第3天開始增高，在缺氧第7天達到最高值，隨后一直保持較高水平（P＜0.05）。見表4，圖1。

表4 NG4、PHDs以及HIF-1α的蛋白表達水平

圖1 NG4、PHDs以及HIF-1α的蛋白表達

2.5 各項檢測指標之間的相關性分析

直線相關分析結果表明，在缺氧狀態下，ING4蛋白表達量與HIF-1α以及RVHI、mPAP、WA%呈負相關，而與PHDs呈正相關，r=0.581，P=0.0017＜0.05。

3 討論

慢性肺源性心臟病是一種嚴重危害著患者的健康和生命的肺心病，大部分均是由慢性阻塞性肺部疾病（COPD）發展而來。肺動脈高壓、肺血管狹窄以及右心室肥厚均是引起慢性肺源性心臟病的根本原因[7-8]。因此研究引起上述病變的發病機制是治療慢性肺源性心臟病的關鍵措施。有研究表明，肺動脈平滑肌細胞的凋亡和增殖失衡是低氧性肺血管重塑發生發展的重要細胞機制，而低氧誘導因子-1（HIF-1）是導致此平衡失衡的關鍵分子，也可以說是調控肺血管重塑發生的“分子開關”[9-11]。本研究利用低氧性肺動脈高壓大鼠模型，也對低氧性肺動脈高壓大鼠中的HIF-1α的表達水平及其意義進行了檢測。結果顯示，HIF-1α的蛋白表達水平在缺氧第3天開始增高，在缺氧第7天達到最高值，隨后一直保持較高水平。同時，從缺氧第7天開始實驗組大鼠的mPAP顯著高于空白對照組（P＜0.05），且第14天達到最高值，且大鼠的RVHI也開始增加，且已形成右心室肥厚和官腔狹窄。這與上述研究結果相一致，表明HIF-1α表達水平會影響肺血管重塑發生。

還有研究表明，氧感受器-HIF脯氨酰羥化酶（PHDs）可通過催化HIF-1α亞基402/564位脯氨酰殘基羥基化，這是其與pVHL結合的識別信號，當二者結合后會啟動HIF-1α的降解過程，因此PHDs是HIF-1α氧依賴性降解的限速酶，也是催化特定脯氨酸殘基羥基化的關鍵[12]。最新發現的一種候補腫瘤抑制蛋白ING4具有與PHD蛋白家族類似的結構，也能參與腫瘤形成和細胞凋亡DNA修復以及細胞周期控制等多種反應過程[13-15]。本研究結果還顯示，在mRNA水平上ING4、PHD2以及PHD3的表達在缺氧第3天開始顯著增高（P＜0.05），而PHD1的mRNA表達水平在缺氧后與空白對照組相比，無顯著差異（P＞0.05）；蛋白水平的結果與mRNA水平相似。這與上述研究結果也相一致。表明，缺氧確實是產生肺動脈高壓和發生血管重塑的重要原因。而且ING4的表達與PHDs蛋白不完全相關，二者共同作用于抑制HIF-1α表達。

綜上所述，在低氧性肺動脈高壓大鼠中ING4和PHDs的表達變化會影響低氧性肺動脈高壓的產生和發展，且需要進步一研究其發病機制和相互調節關系。

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The expression and significanceof ING4 and PHDs in hypoxic pulmonary hypertensive rats

SUN Yongbiao1ZHU Jia2SU Zongyi3LI Li4ZHANG Zhongshuang4

1.Medical College of Shihezi University, Shihezi 832000, China;2.Department of Respiratory Medicine, The People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 832000, China; 3.The Selection and Training Office of Chinese People's Liberation Army for National Defense Students, Shihezi University, Shihezi 832000, China; 4.Department of Basic Medical Sciences of Medical College of Shihezi University, Shihezi 832000, China;

ObjectiveTo discuss the significance that the Expression of ING4 and PHDs in rats with hypoxic pulmonary hypertension.MethodsTo detect the value of RVHI、mPAP、HPVR of rat at different hypoxia time points by establishing rat model of hypoxic pulmonary hypertension.ResultsThe mPAP of the experimental group was significantly higher than that of the blank control group(P＜0.05) from the 7th day of hypoxia, and reached the highest value on the 14th day, and the RVHI of the rats began to increase and formed right ventricular hypertrophy and bureaucratic stenosis. The expression of ING4, PHD2 and PHD3 increased significantly at the 3rd day after hypoxia(P＜ 0.05), and HIF-1α did not change significantly at the beginning(P＜ 0.05). The expression of ING4 protein was significantly increased at the 7th day of hypoxia(P＜0.05), PHD2 and PHD3(P＜0.05), and the protein level of ING4 was significantly higher in the hypoxia group than that in the blank control group(P＜0.05), and protein expression of HIF-1α increased at day 3 of hypoxia (P＜ 0.05), and the protein expression level of PHD1 did not change at the beginning of hypoxia until day 14. Compared with the blank control group, , And then maintained a low level(P＜ 0.05).ConclusionThe Expression changes of ING4 and PHDs of Hypoxic pulmonary hypertension rats can affect the generation and development of hypoxic pulmonary hypertension.

INQA；PHDs；Hypoxic pulmonary hypertensive; Rats

R-332

A

2095-0616（2016）21-29-05

2016-09-12）

國家自然科學基金（81660271）；第十五期石河子大學大學生訓練計劃（SRP2017064）。

△石河子大學醫學院2014級臨床醫學本科

▲通訊作者