鹽知母化學成分α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

高 雁 張 爽 宋澤璧 高 慧

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600

鹽知母化學成分α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

高 雁 張 爽 宋澤璧 高 慧▲

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600

目的對鹽知母化學成分α-葡萄糖苷酶抑制作用進行比較研究，以探討鹽知母降血糖作用的增效原理，為后期研發提供科學依據。方法采用高效液相色譜法，以PNPG（對硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷）為底物比較鹽知母化學成分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結果從鹽知母氯仿層中分離得到的順-扁柏樹脂酚，對α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，且優于阿卡波糖的作用。同時芒果苷、知母皂苷AⅢ等鹽知母的增量成分對α-葡萄糖苷酶抑制作用也相對較強。結論鹽知母活性部位氯仿層分離物，順-扁柏樹脂酚對α-葡萄糖苷酶具有較高的抑制活性，提示鹽知母活性部位分離物順-扁柏樹脂酚在抗糖尿病產品開發方面具有很好的應用前景。

鹽知母；化學成分；α-葡萄糖苷酶；糖尿病

中藥知母的來源為百合科植物知母（Anemarrhenaasphode-loidesBge）的干燥根莖，傳統功效為清熱瀉火、滋陰潤燥[1]。鹽炙法是知母的主要炮制方法，鹽知母為歷版中國藥典所收載，是知母的主流炮制品種。知母鹽炙后能夠符合“用鹽走腎臟”的傳統炮制理論，能夠引藥入腎經，滋陰降火的作用得到增強。本課題組在前期研究鹽知母的藥效作用時，報道過知母能夠降低高血糖大鼠的血糖，且鹽知母作用更為顯著[2-3]，并對鹽知母進行化學成分研究，發現鹽炙后知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷含量升高。對鹽知母活性部位進行化學成分研究[4]，分離得到順-扁柏樹脂酚、構樹寧B、牡荊素[5]。

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病。血糖主要來源于食物中的糖類和碳水化合物，其在α-葡萄糖苷酶的作用下被催化水解成單糖，可被小腸吸收。由此可見，α-葡萄糖苷酶是血糖產生的關鍵酶，有效抑制其作用，可減緩糖尿病患者餐后血糖值[6-8]。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑已廣泛應用于臨床。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過可逆地占據α-葡萄糖苷酶與碳水化合物的結合位點，抑制α-葡萄糖苷酶水解多糖為單糖，從而有效抑制糖尿病患者的餐后血糖升高[9-10]，使患者血糖維持在一定水平，改善血糖穩定指數。

本實驗以鹽知母降血糖活性部位氯仿層分離得到的化合物，順-扁柏樹脂酚、構樹寧B，以及前期分離得到的增量成分知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和現有的芒果苷、新芒果苷、異芒果苷、牡荊素、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E等化學成分從α-葡萄糖苷酶抑制角度，開展體外降血糖比較研究。以期從中尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑。研究結果將對闡明鹽知母降血糖增效原理提供科學內涵，為今后鹽知母臨床用藥提供指導。

1 儀器與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，Agilent 1100型）；PH酸度計（上海鵬順科學儀器有限公司）；十萬分之一分析天平（瑞士METTLER，AE240型）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）。

知母藥材購于西陵知母道地產區（河北省易縣），經對照藥典鑒定為知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖；鹽知母按前期優選的工藝自行炮制。芒果苷對照品（批號111607-200402），購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%；新芒果苷對照品（批號20131214）、異芒果苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：20121221）；知母皂苷AⅢ（批號13042609）、知母皂苷BⅡ（批號13120910）、知母皂苷BⅢ（批號13121110）、知母皂苷E（批號13090301）購自成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%；順-扁柏樹脂酚、構樹寧B，自制，純度≥98%；牡荊素，自制，純度≥98%；阿卡波糖（拜耳醫藥保健有限公司，批號：BJ09769，）；對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海源葉生物技術有限公司）；對-硝基苯酚、牛血清白蛋白純度≥95%、α-葡萄糖苷酶均購自sigma公司；HPLC級甲醇（天津科密歐）、HPLC級乙腈（天津科密歐）、娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液制備 精密稱取適量的新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、牡荊素、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E、順-扁柏樹脂酚、構樹寧B、阿卡波糖的對照品，分別配制成濃度為0.270mg/mL、0.233mg/mL、0.234mg/mL、0.207mg/mL、0.287mg/mL、0.496mg/mL、0.192mg/ mL、0.560mg/mL、0.246mg/mL、0.214mg/mL、0.203mg/mL的樣品溶液。

1.2.2 反應溶液的制備 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）：稱取K2HPO4·3H2O、KH2PO4適量（7.6834g、4.5819g），用超純水溶解，調整pH至6.8，然后定容500mL，置冰箱保藏。

α-葡萄糖苷酶：取α-葡萄糖苷酶，用含0.2% BSA上述磷酸緩沖溶液溶解，配制成α-葡萄糖苷酶儲備溶液（0.3U/mL）。

PNPG溶液：精密稱取適量 PNPG，用少許緩沖溶液溶解，然后定容于10mL，置冰箱保藏。

Na2CO3終止劑：稱取2.162g Na2CO3，用少許超純水溶解，然后定容于100mL。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定[11-14]取1.5mL離心管中，向其中加入10μL磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）和30μL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，于37℃孵育20min，加入40μL PNPG（8.0mmol/L）開啟反應，振蕩混勻，于37℃反應30min，之后加入80μL Na2CO3（0.2mol/L）終止反應，再加水稀釋，至500μL，振蕩混勻，過濾。采用HPLC法，檢測產物中PNP的濃度，計算α-葡萄糖苷酶的活性。

取1.2.1中各樣品溶液作為待測樣品，以相同體積代替緩沖溶液加入到反應體系中。同時設置陽性對照（以等體積的Acarbose代替磷酸鹽緩沖溶液）、空白對照（以等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酶液），測試各個單體成分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，計算抑制率：抑制率=A-B/A×100%式中，A為不加待測樣品時PNP的濃度（扣除相應空白，mmol/L）；B為加入待測樣品后PNP的濃度（扣除相應空白，mmol/L）。

1.2.4 HPLC法測定PNP的含量 色譜條件：Ecosil色譜柱（4.6mm×250mm，120-5-C18AQ，5μm），流動相為乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件為：0～8min，20%～29%A；8～14min，29%～80%A；14～18 min，80%～20%A；18～28min，20%～20%A；以314nm為檢測波長，流速為1.0mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為室溫。

PNP標準曲線：精確稱取PNP標準品置50mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解后，加磷酸鹽緩沖溶液至刻度，制備PNP儲備液（5.68mmol/L）。將儲備液稀釋成1.136mmol/L、0.568mmol/L、0.284mmol/L、0.170mmol/L、0.0568mmol/L、0.0284mmol/L、0.0170 mmol/L，按照上述梯度洗脫條件，分別進樣，以所得峰面積為縱坐標，以PNP濃度為橫坐標，繪制標準曲線。按照上述色譜條件，各待測樣品反應溶液分別進樣，根據峰面積計算濃度。

2 結果

2.1 PNP標準工作曲線

求得PNP標準曲線的回歸方程為y=36057x+459.08，r=0.9993， 說 明 PNP在0.017～1.136mmol/L與峰面積之間呈現的線性關系。

2.2 鹽知母化學成分對α-葡萄糖苷酶抑制作用

實驗結果顯示：各化合物中以從鹽知母活性部位中分離得到的順-扁柏樹脂酚對α-葡萄糖苷酶抑制作用最強，且明顯優于阿卡波糖的作用。同時芒果苷、知母皂苷AⅢ等鹽知母的增量成分對α-葡萄糖苷酶抑制率也相對較高。見表1。

表1 各成分對α-葡萄糖苷酶的抑制率

3 討論

目前，評價藥物降血糖作用的指標主要為血糖以及胰島素水平。血糖水平評價主要包括體內空腹血糖、糖耐量以及體外酶抑制兩方面。本實驗采用PNPG為底物的酶抑制劑篩選模型進而評價鹽知母化學成分的降血糖作用，該方法快捷、簡單易于操作。

合成類藥物包括阿卡波糖、伏格列波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑已廣泛應用于臨床[15]。但由于存在一些副作用。所以，更多的研究著重于從中藥中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，為了尋找到更安全、高效的糖尿病治療藥。本實驗對現有的鹽知母化學成分進行酶抑制作用研究。實驗結果顯示，從鹽知母降血糖活性部位氯仿層中分離得到的順-扁柏樹脂酚，對α-葡萄糖苷酶抑制作用最強。同時芒果苷、知母皂苷AⅢ等對α-葡萄糖苷酶抑制率也相對較高。這就提示鹽知母降血糖作用顯著增強可能與鹽知母的新增成分及增量成分有關，在以后工作中將進一步予以研究。因此，本實驗為研究鹽知母化學成分酶抑制劑提供了理論依據，為鹽知母作為糖尿病治療藥的進一步開發利用提供了科學參考。

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Study on inhibitory effect of chemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma on α-glucosidase

GAO Yan ZHANG Shuang SONG Zebi GAO Hui
School of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China

ObjectiveTo compare the inhibitory effect of chemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma on α-glucosidase, to explore itsthe synergistic effects ofhypoglycemic mechanism, and to provide the scientific basis for later research.MethodsWith the method of HPLC, PNPG was used as substrate to compare the α-glucosidase inhibition effect between the differentchemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma.ResultsThe separation from the salt AnemarrhenaeRhizoma by chloroform-cis-hinokiresionl had a strong inhibitory effect onαglucosidase, and it was better than the positive control group acarbose. The incremental compontensin the salt AnemarrhenaeRhizomalike mangiferin and timosaponin AⅢ groups showed a certain inhibition.ConclusionThe extraction of the salt processed AnemarrhenaeRhizoma by chloroform-cis-hinokiresionl can inhibit α-glucosidase activity obviously, which reminds us it has good application prospects in product development of antidiabetics.

SaltAnemarrhenaRhizoma;Chemical components;α-glucosidase;Diabetes

R284

B

2095-0616（2016）21-60-03

2016-08-02）

國家自然科學基金項目（81102810）；遼寧省自然科學基金項目（201320165）。

▲通訊作者