膠滴腫瘤藥敏檢測技術對膀胱灌注化療藥物選擇的臨床研究

王美才周榮升周祥舉龐 昆▲韓從輝

1.江蘇省沭陽縣中心醫院泌尿外科，江蘇沭陽 223600；2.東南大學附屬徐州市中心醫院泌尿外科，江蘇徐州 221000

膠滴腫瘤藥敏檢測技術對膀胱灌注化療藥物選擇的臨床研究

王美才1周榮升2周祥舉2龐 昆2▲韓從輝2

1.江蘇省沭陽縣中心醫院泌尿外科，江蘇沭陽 223600；2.東南大學附屬徐州市中心醫院泌尿外科，江蘇徐州 221000

目的研究膠滴腫瘤藥敏檢測技術對膀胱灌注化療藥物選擇的作用。方法對145例行經尿道等離子電切的膀胱癌患者進行隨訪，根據是否采用腫瘤藥敏檢測分為兩組，A組根據藥敏檢測技術采用吡柔比星、表柔比星、絲裂霉素或吉西他濱灌注化療，B組不經藥敏檢測，根據經驗僅采用吡柔比星灌注化療。比較兩組患者的年齡、性別、是否吸煙、腫瘤級別、腫瘤大小等基線資料；采用生存分析模型比較組間腫瘤復發率和復發時間。結果兩組患者在年齡（P=0.2915）、性別（P=0.5268）、是否吸煙（P=0.8915）、腫瘤級別（P=0.1931）和腫瘤大小（P=0.1655）的差異無統計學意義；兩組患者隨訪復發率比較有統計學差異（P=0.0298＜0.05）。生存分析結果：兩組之間復發時間差異有統計學意義（χ2=6.663，P=0.0098＜0.05）。結論使用CD-DST法對體外原代膀胱尿路上皮癌細胞進行膀胱灌注化療藥物敏感度測定，可以有效選擇敏感化療藥物，有效降低膀胱癌復發率，并有效推遲膀胱癌復發時間，為膀胱灌注化療的個體化藥物選擇上，有重要意義。

膀胱灌注化療；膠滴腫瘤藥敏檢測技術；藥物選擇；復發率；生存曲線分析

淺表性膀胱癌的治療首選經尿道膀胱腫瘤電切除（TUR-Bt），但術后復發率較高，40%～70%的膀胱癌患者在術后1年內復發[1]。術后的膀胱灌注化療成為預防膀胱癌復發的關鍵治療措施。但是目前在膀胱灌注化療藥物的選擇上，臨床上具有盲目性和經驗用藥的隨眾性。目前國內文獻報道的膀胱灌注化療藥物的選擇方法有兩種：基因選擇法[2]和腫瘤藥敏法[3]。其中，腫瘤藥敏法作為一種較為經濟、有效、方便的選擇方法，得到臨床醫生的重視。徐州市中心醫院自2012年起開始應用膠滴腫瘤藥敏檢測技術（CD-DST法）作為膀胱灌注化療藥物的選擇依據；同時，部分患者未選擇該法，并采用吡柔比星經驗用藥。我科對共計145例淺表性膀胱癌患者進行跟蹤隨訪，研究CD-DST法對膀胱灌注化療的指導作用。

表1 兩組基線資料比較結果

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年7月～2014年7月在沭陽縣中心醫院泌尿外科和徐州市中心醫院泌尿外科因膀胱癌行經尿道等離子電切術的145例患者進行跟蹤隨訪。兩組患者在年齡（P=0.2915）、性別（P=0.5268）、是否吸煙（P=0.8915）、腫瘤級別（P=0.1931）和腫瘤大小（P=0.1655）的差異無統計學意義，具有可比性（見表1）。根據是否行腫瘤藥敏實驗檢測分為兩組，A組藥敏實驗組，根據藥敏檢測技術采用吡柔比星、表柔比星、絲裂霉素或吉西他濱灌注化療；B組非藥敏實驗組，不經藥敏檢測，根據經驗僅采用吡柔比星灌注化療，對隨訪結果進行比較，采用生存分析模型對復發率進行比較分析。注射用鹽酸表柔比星（速溶）（輝瑞制藥有限公司，H20000496）注射用鹽酸吡柔比星（海正輝瑞制藥有限公司，H20045983）絲裂霉素注射粉針（浙江海正藥業股份有限公司，H33020786）注射用鹽酸吉西他濱（江蘇豪森藥業股份有限公司，H20030105）。

1.2 CD-DST法

將新鮮的膀胱尿路上皮癌組織在無菌條件下將腫瘤組織剪碎，膠原酶消化，獲得單細胞懸液。離心后接種于I型膠原蛋白包被的培養瓶中，培養出原代膀胱尿路上皮癌細胞；棄去未貼壁的死細胞，獲得單細胞懸液。在冰浴的條件下，將I型膠原蛋白溶液、10×F12培養基和緩沖溶液按8：1：1體積比混合制成膠原蛋白混合溶液，將腫瘤細胞懸液加入膠原蛋白混合溶液，調整細胞濃度為1×105個/mL。在冰浴的條件下，將膠原蛋白-細胞混合溶液接種于6孔細胞培養板，形成膠滴后加入培養基培養。細胞培養板培養24h后，分別加入THP及 EPI，同時設陰性對照孔。藥物作用下培養24h，洗去抗癌藥物，加入培養基，繼續 培養7d。并通過中性紅染色固定干燥后，利用Scion Image分析系統通過倒置顯微鏡對膠滴中細胞的染色情況進行掃描，結果傳輸到計算機。通過圖像軟件，設定亮度值128為閾值，可以排除染色較淺的成纖維細胞，直接計算腫瘤細胞形成的克隆進行吸光度（A）值測定，計算出藥物的抑制率。

1.3 膀胱灌注化療

表柔比星采用50mg溶于40mL無菌5%葡萄糖溶液中經導尿管灌入膀胱，并囑患者立位、左側臥位、右側臥位、仰臥位、俯臥位各持續12min，共計1小時后排空膀胱；吡柔比星采用30mg溶于40mL無菌生理鹽水溶液中；吉西他濱采用1g溶于40mL無菌生理鹽水溶液中；絲裂霉素20mg溶于40mL無菌生理鹽水溶液中，后三者灌注、體位與保留時間均同表柔比星。

藥敏實驗組每位患者均術后即刻（8小時內）灌注吡柔比星1次，然后術后1周根據藥敏結果進行灌注化療，每周1次共計8次，然后每月1次滿2年。非藥敏實驗組術后即可灌注吡柔比星1次，其余灌藥時間同藥敏實驗組，但灌注藥物均為吡柔比星。兩組患者均每月進行膀胱彩超檢查，可疑者進行膀胱鏡檢查，每3個月進行一次膀胱鏡檢查確定是否復發，隨訪期為2年，因2年未復發者無需膀胱灌注，失訪率較高，隨訪2年后結果未納入研究。

1.4 基線數據比較

比較兩組患者的年齡、性別、是否吸煙；比較兩組數據的腫瘤級別（低、中、高）、腫瘤大小（mm）。

1.5 結果比較

比較兩組之間腫瘤復發概率和復發時間。

1.6 統計學方法

表3 兩組不同時間累積治愈數與治愈率比較[n（%）]

2 結果

兩組患者隨訪復發率比較有統計學差異有統計學意義（P=0.0298＜0.05，表2）。療效分析，兩組患者在不同治療階段復發狀況見表3，生存曲線（治愈曲線）不交叉（圖1），采用Log-Rank檢驗，兩組間有統計學差異（χ2=6.663，P=0.0098＜0.05）。采用COX生存曲線分析模型將兩組復發患者進行治愈曲線分析，差異有統計學意義，兩組間比較結果見表4。采用藥敏法選擇敏感藥物行膀胱灌注，會推遲腫瘤復發時間。

表2 兩組復發率比較結果[n（%）]

表4 兩組復發患者治愈曲線

3 討論

膀胱癌是美國男性排名第四、女性排名第九的惡性腫瘤，在我國是排名第十的惡性腫瘤[4]。其中，膀胱尿路上皮癌占93.2%，分期Tis、T1、T2占88.6%[5]。術后復發率較高，40%～70%的膀胱癌患者在術后1年內復發[1]。行TUR-Bt的Tis及T1患者，三年復發率為45.2%，復發時間平均為（11.0±9.0）個月，三年生存率為T1以下93.4%，T2期72.2%[5]。

圖1 兩組患者累積治愈曲線

目前膀胱癌的治療方式有很多，TUR-Bt仍然是Tis、T1、T2期手術的金標準，目前還有膀胱部分切除術[6]、鈥激光膀胱腫瘤切除術[7]和綠激光膀胱腫瘤切除術[8]等。術后的膀胱灌注化療成為預防膀胱癌復發的關鍵治療措施。目前在膀胱灌注化療藥物的選擇有很多[9-13]：（1）吡柔比星；（2）吉西他濱；（3）絲裂霉素；（4）表柔比星；（5）吉西他濱和吡柔比星交替膀胱灌注化療；（6）其他聯合灌注化療。但目前膀胱灌注化療的選擇仍靠臨床經驗或某些研究成果，無統一標準，中國泌尿外科疾病診斷與治療指南也未提供灌注藥物的選擇方法。以往我們一般膀胱癌術后灌注藥物根據自己的經驗或參考相關文獻選擇灌注藥物，膀胱尿路上皮癌的術后復發率較高。復發后再次均選擇經尿道腫瘤腔鏡切除術（電切或激光），更換另外一種藥物進行灌注，但是選擇的藥物具有隨機性，因為不知道此患者對什么藥物敏感。膀胱灌注化療藥物選擇上具有盲目的、經驗性、隨機性。自從引入CD-DST后，手術中切除腫瘤送病理前常規留取部分腫瘤組織行腫瘤藥敏實驗，然后根據藥敏實驗結果選擇最佳藥物，明顯降低腫瘤術后復發率、推遲腫瘤復發時間。

陳震[3]和肖振東等[14]早在2009年就對MTT法腫瘤藥敏試驗在膀胱灌注化療藥物的選擇上做出研究，初步證實了腫瘤藥敏實驗在膀胱灌注化療藥物選擇中起到的重要作用。徐州市中心醫院病理科采用新式腫瘤藥敏檢測方法，即CD-DST法應用于臨床，指導膀胱灌注化療用藥。本研究中，使用腫瘤藥敏實驗來選擇膀胱灌注化療的藥物，可以明顯降低膀胱癌復發率，并可以推遲中位復發時間。

CD-DST體外腫瘤藥敏檢測技術是一種較好的藥敏檢測方法，其所需標本量較小，約1mm3即可，不會影響常規病理標本的留取，彌補了目前其他藥敏技術的不足[15]。而且原代培養成功率高、能夠排除成纖維細胞對實驗的干擾，在體外對抗癌藥物的特異性殺傷作用做出客觀評價。CD-DST體外腫瘤藥敏檢測技術可反映患者對不同抗腫瘤藥物敏感性的差異，檢測結果與臨床經驗有效率有較好的符合性，對抗腫瘤藥物的體外篩選和對個體化治療具有較高的實用性意義。

本研究表明，使用CD-DST法腫瘤藥敏檢測技術對體外原代膀胱尿路上皮癌細胞進行膀胱灌注化療藥物敏感度測定，可以有效選擇敏感化療藥物，有效降低膀胱癌復發率，并有效推遲膀胱癌復發時間，為膀胱灌注化療的個體化藥物選擇上，有重要意義。

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Clinical study of collagen gel droplet culture-drug sensitivity test for choosing intravesical chemotherapy of bladder cancer

WANG Meicai1ZHOU Rongsheng2ZHOU Xiangju2PANG Kun2HAN Conghui2
1.Department of Urology,Shuyang County Central Hospital,Shuyang 223600,China;2.Department of Urology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221000，China

ObjectiveTo study the collagen gel droplet culture-drug sensitivity test （CD-DST） for choosing intravesical chemotherapy of bladder cancer.MethodsAccording to the drug susceptibility testing technology,145 transurethral bladder cancer patients were divided into two groups.Group A used topiramate,doxorubicin,epirubici n, mitomycin,or gemcitabine chemotherapy and Group B used topiramate or doxorubicin without drug susceptibility testing.Comparing the basic data of patients,such as age,sex,smoking,tumor grade and tumor size.Tumor recurrence and recurrence interval can be found by using cox survival curve model.ResultsThere were not significant differences in age（P=0.2915）, sex（P=0.5268）, smoking（P=0.8915）,tumor grade（P=0.1931）,and tumor size（P=0.1655）,while it was statistically significant （P=0.0298＜0.05） in terms of relapse rate.The use of the drug susceptibility method to select sensitive bladder perfusion,would delay tumor recurrence （χ2=6.663,P=0.0098＜0.05）.ConclusionCDDST method of primary urothelial bladder cancer infusion chemotherapy sensitivity assay can effectively choose the sensitive chemotherapy drugs to effectively reduce the recurrence rate of bladder cancer in vitro.It is important to postpone the time of bladder cancer recurrence and effectively to choose intravesical individualized chemotherapy.

Intravesical chemotherapy;The collagen gel droplet culture-drug sensitivity test （CD-DST）;Drug selection;Recurrence rate;Cox survival curve model

R737.33

B

2095-0616（2016）21-80-04

2016-09-12）

江蘇省重點研發計劃（BE2015623）；江蘇省“科教興衛”工程醫學重點人才科研項目（RC2011046）。

▲通訊作者