感染T細胞斑點試驗在耐多藥肺結核診斷中的應用價值

胡鈺卿潘愛珍王 靜朱 敏▲

1.杭州市紅十字會醫院結核實驗室 ，浙江杭州 310003；2.浙江省疾控中心結核病預防控制所結核實驗室，浙江杭州 310051

感染T細胞斑點試驗在耐多藥肺結核診斷中的應用價值

胡鈺卿1潘愛珍2王 靜1朱 敏1▲

1.杭州市紅十字會醫院結核實驗室 ，浙江杭州 310003；2.浙江省疾控中心結核病預防控制所結核實驗室，浙江杭州 310051

目的分析探討感染T細胞斑點試驗（TSPOT.TB）在耐多藥肺結核診斷中的應用價值。方法選擇2014年1月～2016年1月我院收治的耐多藥肺結核患者71例，另選擇35例同期健康體檢者作為對照組，比較各種檢測方法診斷的敏感性，并采用特異性、準確度作為診斷試驗的評價指標。結果T-SPOT.TB檢測診斷耐多藥肺結核敏感性最高，達95.6%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。抗酸桿菌涂片、結核菌培養、T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的敏感性較高，達90%以上。T-SPOT. TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的特異度最高，達91.9%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。 T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的準確度最高，達96.2%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。結論與其他檢查方法相比，感染T細胞斑點試驗對診斷耐多藥肺結核具有特異性高、準確度高的優點，值得廣泛推廣和應用。

耐多藥肺結核；感染T細胞斑點試驗

結核病是一種慢性傳染病，是由結核分支桿菌感染引起的疾病，其中最為常見的是肺部結核。近年來全球結核病疫情呈回升狀態，耐藥結核菌發生率不斷增加。其中，耐多藥肺結核指結核菌至少同時對利福平、異煙肼兩種抗結核藥物耐藥，發病率較高，約占全世界25.0%，還存在持續向外播散耐多藥結核菌情況[1]。耐多藥肺結核治療難度大，治療周期長，治愈率低，因此，尋找特異的檢測方法，快速且準確診斷是結核病控制的關鍵問題，且對于監測結核病的發展及轉歸及臨床治療具有重要意義。結核菌素試驗（purified protein derivative tuberculin，PPD）為診斷結核病的主要方法，但假敏感性較高[2]。結核感染T細胞斑點試驗（TB infection of T cells spot test，TSPOT.TB）為一種新型的診斷方法，敏感性和特異性水平較高。本研究選取疑患結核病例，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2016年1月我院收治的耐多藥肺結核患者71例，入選研究對象均知情同意，均排除合并嚴重心、腦、肝、腎、消化系統等疾病者。其中男38例，女33例；年齡22～67歲，平均（41.2±6.2）歲；病史0.5～3年，平均 （14.1±3.2）月。疾病類型：原發性肺結核 15例，繼發性肺結核40例，血型播散型肺結核16例。另選擇35例同期健康體檢者作為對照組，其中男18例，女17例；年齡20～58歲，平均（42.3±5.4）歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 T-SPOT.TB試驗 取枸櫞酸鈉抗凝的靜脈血5mL，分離外周血單核細胞（PBMC） 放在包被IFN-7抗體的微孔板，加入結核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶向抗原（ESAT-6） 和培養基濾過蛋白（CFP-10）作為抗原，37℃溫箱培養24h后，洗去抗原致敏效應T淋巴細胞，加入生物素標記的二抗，再經酶聯顯色，在細胞因子分泌的地方形成斑點，通過記錄斑點數檢測結核分枝桿菌特異抗原致敏的效應T淋巴細胞數量。采用上海復星科技有限公司提供的試劑盒。

1.2.2 結果判斷 當空白對照孔內斑點數＜6時，任一實驗孔斑點數減去空白孔斑點數≥6，結果即為陽性；若空白對照孔斑點數＞6，任一實驗孔斑點數大于空白孔斑點數的兩倍，結果也表示陽性[3]。

1.2.3 其他檢查方法 （1）PPD試驗。采用Mantoux法，取PPD 0.1mL（含5單位結核菌素）行前臂尺側皮內試驗，48～72h后觀察結果。硬結直徑≥10mm為TST陽性結果。（2）血清結核抗體檢測。采用蛋白芯片閱讀儀，結核分枝桿菌蛋白芯片試劑盒均為南京大淵生物技術公司提供，結核分枝桿菌蛋白芯片試劑盒檢測結核桿菌三種特異性抗體， 即抗脂阿拉伯甘露糖（LAM）、16kDa 及38kDa抗體，如果任一抗體檢測為陽性，結果則判為陽性。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，整個檢測過程不超過30min。（3）結核DNA檢測。將痰液中提取DNA模板加入PCR反應管，按規定循環參數進行PCR反應。（4）其他。抗酸桿菌涂片與結核分枝桿菌培養，具體檢測方法同中國防癆協會基礎專業委員會主編《結核病診斷實驗室檢驗規程》2006版。

1.3 評價指標

采用敏感性、特異性、準確度作為診斷試驗的評價指標。（1）敏感度=真陽性例數／（真陽性例數+假陰性例數）×100%，（2）特異度=真陰性例數／（真陰性例數+假陽性例數） ×100%。

準確度=真陽性＋真陰性/（真陽性+真陰性＋假陽性＋假陰性）×100%。

1.4 統計學處理

數據處理采用SPSS20.0統計學軟件進行處理和分析， 計數資料采用χ2檢驗，計量資料以（）的形式表示，組間比較分析采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 T-SPOT.TB檢測與其他各項檢測方法診斷耐多藥肺結核的敏感性、特異性、準確度比較

表1結果顯示，抗酸桿菌涂片、結核菌培養、T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的敏感性較高，達90%以上。T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的特異度最高，達91.9%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統計學意義（P＜0.05）。且表2結果還證實，T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的準確度最高，達96.2%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各檢測方法診斷耐多藥肺結核的敏感性、特異性、準確度比較[%（n/n）]

2.2 T-SPOT.TB檢測與其他各項檢測方法診斷耐多藥肺結核敏感性比較

表2結果顯示，PPD、結核PCR、結核菌培養、T-SPOT.TB檢測方法用于耐多藥肺結核檢測的敏感性顯著高于對照組，組間比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。且表1數據分析顯示，T-SPOT.TB檢測診斷耐多藥肺結核敏感性最高，達95.6%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

結核病是全球嚴重的公共衛生問題之一，據WHO估計，全球有約20億人感染結核分枝桿菌，每年有約200萬人死于結核[4]。我國是結核病高發國家之一，2000年全國結核病流行病學調查顯示，全國受結核菌感染人數約5.5億，其中傳染性肺結核病患者150萬人，每年因結核病死亡的人數達13萬人。近年來結核病的發病率有上升趨勢，且耐藥趨勢較嚴重。因此，如何及早發現疾病并快速精準的進行診斷成為臨床研究的重點。

表2 T-SPOT.TB檢測與其他各項檢測方法診斷耐多藥肺結核敏感性比較[n（%）]

結核菌素試驗（TST）是臨床常用于結核篩查的常用方法之一，但假陽性率高，且易受患者身體狀況影響而影響結果。體外核酸擴增技術即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）自1989年法國學者Brissonneol等首先報道用于診斷結核病，為結核病的快速診斷開辟了新途徑，但由于其假陽性率較高影響了結果的可靠性。結核抗體檢測試驗敏感度較差、對潛伏性肺結核的篩查意義不大、價格昂貴。TSPOT.TB技術通過計算斑點的數量推測出患者體內結核桿菌產生反應的效應T細胞是否存在[5-7]。T.SPOT實驗結合酶聯免疫斑點技術（即ELISPOT技術）與r-干擾素釋放試驗，通過檢測受結核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應T細胞來診斷結核感染[8-10]。結核感染后體內長期存在抗原特異性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放r-干擾素[11-13]。實驗中利用ESAT6和CFP10兩種結核特異性抗原刺激外周血中結核特異性T淋巴細胞分泌 r-干擾素，并通過ELISPOT方法檢測r-干擾素的釋放水平，從而判斷機體是否感染結核桿菌。對活動性結核分枝桿菌感染具有較高的敏感性[14-16]。且TSPOT.TB的檢測價格便宜、簡單易行[17-19]。將TSPOT.TB與PPD試驗相比，TSPOT.TB屬于體外試驗，PPD 試驗屬于體內試驗；PPD試驗的結果受多重因素制約，其臨床應用受到一定的局限性，在肺結核感染的高發地帶為患者進行PPD 試驗的假陽性呈不斷增多的趨勢[20-22]；本研究選擇71例耐多藥肺結核患者作為研究對象，另選擇35例同期健康體檢者作為對照組，比較各種檢測方法診斷的敏感性，并采用特異性、準確度作為診斷試驗的評價指標。結果證實，T-SPOT.TB檢測診斷耐多藥肺結核敏感性最高，達95.6%， T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的特異度最高，達91.9%， T-SPOT.TB檢測用于診斷耐多藥肺結核的準確度最高，達96.2%，顯著高于其他各項檢測方法，差異具有顯著性（P＜0.05）。與張玉平等[23]報道觀點相符，與其他檢查方法相比，TSPOT.TB對診斷耐多藥肺結核具有特異性高、準確度高的優點。

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Application value of T.SPOT-TB test in the diagnosis of Multidrug Resistant Patients with Pulmonary Tuberculosis

HU Yuqing1PAN Aizhen2WANG Jing1ZHU Min1
1.Tuberculosis laboratory, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310003, China; 2.Tuberculosis Laboratory, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and prevention, Hangzhou 310051, China

ObjectiveTo analyze and discuss the application value of T.SPOT-TB test in the diagnosis of Multidrug Resistant Patients with Pulmonary Tuberculosis.Methods71 multi-drug resistant patients with pulmonary tuberculosis in our hospital from January 2014 to January 2016 were selected,In addition, 35 healthy persons were selected as control group. The sensitivity of the various diagnostic methods was compared. Specificity and accuracy were used as the evaluation indexes of diagnostic tests.Resultsthe positive rate of T-SPOT.TB in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, reaching 95.6%, which was significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜ 0.05). The sensitivity of acid-fast bacilli sputum smear, culture of bacteria and T-SPOT.TB testing in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis were high, reached more than 90%. The specificity of T-SPOT.TB detection for the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, up to 91.9%, significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜ 0.05). The accuracy of T-SPOT.TB detection in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis was the highest, up to 96.2%, significantly higher than other detection methods, and the difference was significant(P＜0.05).ConclusionCompared with other examination methods, T.SPOT-TB test has the advantages of high specificity and high accuracy in the diagnosis of multi drug resistant pulmonary tuberculosis. It is worth popularizing and applying. It is worth popularizing and applying.

Multi drug resistant pulmonary tuberculosis; T.SPOT-TB test

R446.1

B

2095-0616（2016）21-147-04

2016-09-10）

▲通訊作者