異種骨移植與大段骨缺損修復現狀及研究進展

趙文博，張　智，陽　波，葉永杰

(遂寧市中心醫院，四川 遂寧　629000)

?

異種骨移植與大段骨缺損修復現狀及研究進展

趙文博，張智，陽波，葉永杰

(遂寧市中心醫院，四川 遂寧629000)

由創傷、腫瘤、代謝疾病等所致的大段骨缺損的治療一直是臨床難題，而骨移植為目前廣泛采用的治療方式。目前有多種骨移植物可供選擇，它們各有優缺點，其中的異種骨因其特有優勢在創傷骨科以及腫瘤骨科中發揮著日益重要的作用，具有較為突出的臨床和學術意義。然而目前尚未完全解決異種骨抗原性、移植后的免疫反應、制作工藝等問題。如何制作出更符合臨床應用標準的異種骨移植物是相關領域的研究重點。本文就上述問題對近年來的研究成果進行綜述，以期為異種骨移植的進一步研究與應用提供參考。

骨移植；骨缺損；異種骨；骨組織工程

優先數字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160628.1836.008.html

由創傷、腫瘤、代謝疾病等所致大段骨缺損的治療一直是臨床難題[1]，其主要治療方式為骨移植，材料包括自體骨、同種異體骨、人工骨、異種骨等。骨移植已成為僅次于輸血的同種異體組織移植，每年有超過兩百萬例骨移植手術在全世界范圍內開展[2]，其所帶來的臨床價值及經濟效益促使人們不斷探索更為有效、合理的骨移植物。自體骨移植依然被視為大段骨缺損治療的“金標準”[3-4]，然而因來源限制、為獲取移植物而額外增加的手術創傷、術后疼痛和并發癥等[5]缺點，限制了自體骨的臨床應用。改良后的同種異體骨盡管更符合骨移植物標準[6]，卻存在增加疾病傳播的風險、骨誘導能力和生物力學性能較差、耗費較高等缺點。人工骨來源廣泛并具有免疫原性低的優點，但其理化性質和生物性能無法企及天然骨，同時其降解吸收也難以控制，臨床應用環境還不夠成熟。以小牛骨、豬骨為代表的異種骨在修復骨缺損方面具有其獨特的優勢[7-8]。異種骨來源廣泛，制造成本低，易于獲得和加工，由于骨質中磷灰石的結構在不同種屬間類似，較于人工骨，異種骨可形成多孔隙三維結構，有著更好的生物力學性能和骨傳導性[9]，作為天然骨移植材料有著巨大潛在臨床應用價值。然而異種骨的應用有賴于消除其免疫原性，同時保存成骨和骨誘導能力，這也給異種骨移植相關研究提出了挑戰。本文就異種骨的免疫原性、制備方式、重組等方面的研究進展進行綜述。

1　異種骨移植物的免疫原性及免疫排斥

異種骨中含有的抗原主要為：α-半乳糖基抗原(α-galactose base antigen,α-Gal)、主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)、骨髓、血液及膠原蛋白[10]，其中以α-Gal和MHC為主。此前研究已表明，α-Gal是影響異種骨移植存活的最為重要的抗原，為公認的普遍存在于靈長目以外的哺乳動物體內的異種抗原，其可以引起補體激活、超急性免疫反應以及急性異種血管排斥反應[11-12]； MHC為骨細胞表面的糖蛋白抗原，包括MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ。Feng等[13]研究表明，豬骨組織中α-Gal主要分布于皮質骨和髓質骨的骨細胞和成骨細胞表面，MHC-Ⅰ存在于骨髓細胞、骨細胞、成骨細胞的表面，MHC-Ⅱ只存在于骨髓細胞表面。

除此之外，尚有其他組分參與到免疫排斥中，Sun等[14]通過將兔異種骨移植到已注射白介素(interleukin,IL)-17中和抗體的小鼠中，發現IL-17和IL-23參與到異種骨移植的免疫排斥中，其中IL-17/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)通路可能在異種移植骨骼重吸收過程中起關鍵作用。

異種骨引起的免疫排斥反應主要有2種：(1)體液免疫。α-Gal抗原主要通過間接識別途徑與天然存在人體血清中的抗體相結合，其所介導的細胞毒效應導致血管內皮細胞溶解、血栓形成、炎性反應等免疫排斥。(2)細胞免疫。異種骨植入體內后，集體通過免疫細胞對抗原進行攝取、處理以及提呈，進而引起T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化，發生細胞免疫。異種骨移植為游離骨組織移植，并不直接暴露于血液中，因而不會出現明顯的超急性排斥反應。細胞介導的免疫排斥在此過程中占主要作用。

由異種抗原引起的免疫排斥反應依然是異種骨移植中最大的障礙。Seebach等[15]發現，異種骨移植后初期其內存活的細胞具備成骨能力，但由于免疫排斥作用以及NK細胞介導的細胞毒性作用，其移植物中的細胞可被殺死，早期成骨亦會被吸收。異種骨移植須在不影響成骨能力的前提下去除具有抗原性的蛋白和脂質，因此如何更好地制備異種骨移植物以及去除其中抗原與異種骨移植成功率息息相關。

2　異種移植物的制備

異種骨的制備是異種骨移植取得成功的前提和基礎，其目的在于盡可能減少或去除其中的抗原成分，弱化亦或是消除免疫排斥反應，同時保留其原有的三維形態結構和生物力學性能，提高骨移植的安全性和有效性。異種移植物的來源理論上不受限制，現今較常見的有豬骨和小牛骨，其主要制備方式有物理方法(低溫冷凍、高溫煅燒、超聲)、化學方法(脫脂、脫蛋白、脫細胞)以及多種方式聯合運用等。

低溫冷凍方法是目前用于制備異種骨移植物較常用的方法之一。通過深低溫冷凍技術破壞細胞表面的抗原結構，降低免疫原性，但同時也會改變移植物的骨誘導活性且單用此法無法完全去除免疫原性。Ribeiro等[16]回顧了阿雷格里港醫院2000—2013年行髖關節置換翻修術中運用凍干異種骨治療髖臼骨缺損的14例患者的情況，發現其中85.7%的患者有新骨形成，并覆蓋了61.79%的骨缺損區域，均未出現炎癥反應和排異反應，證實凍干骨有良好的骨誘導能力。J?hn等[17]采用快速凍融循環、X線照射及紫外線照射等3種方法處理羊骨，結果顯示快速凍融循環處理異種骨簡單易行，耗時較少，效果可靠。

高溫煅燒的優點主要在于可降低或徹底去除異種移植物的免疫原性，且保留天然骨原有無機鹽骨架以及三維框架結構，但會對支架的生物力學特性產生影響，如脆性增大，力學強度及成骨能力較低。有研究顯示，當煅燒溫度超過600 ℃時異種骨抗壓性能會增強，脆性增加，但相應的降解性會下降。

目前物理方法制備異種骨的研究熱點主要集中于低晶度材料，因其有更大的表面積、孔徑和容積。這些特性對于成骨細胞的生長、移植材料的降解以及骨的再生都極為重要。Go等[18]用豬股骨分別經過400 ℃以及1 200 ℃環境煅燒后(低溫煅燒后的移植物結晶度較低)，形成不同結晶度的移植物，并被磨碎至直徑小于1 mm的顆粒，而后移植到顱骨部分缺損的大鼠中，發現低結晶度移植物有更多成骨細胞黏附和更好的成骨性能，新生骨密度更高。

化學方法主要包括脫脂和脫蛋白等。脫脂可去除移植物哈弗氏管腔中的脂肪以及脂蛋白成分，常用的有氯仿/甲醇混溶劑、乙醚、超臨界CO2等。傳統化學試劑有一定毒性，不利于骨細胞黏附及骨再生；超臨界CO2目前對設備及成本要求較高，尚難以普及。脫蛋白法會使部分膠原蛋白變性，改變其力學強度。

為了制備出更好的異種骨移植物，目前更為提倡物理化學方法的聯合使用。Cho等[19]將小牛骨顆粒經過脫脂、清洗，并浸潤于含次氯酸鈉的溶液中，此后干燥并與次氯酸鈉一同加熱至1 000 ℃而制備成的新型異種骨，結果表明其有更高的離子溶解度、較低結晶度以及良好的骨傳導性，是一種具有發展潛力的異種移植物。

異種骨移植降低抑或消除免疫原性的另一種方式為清除表面抗原物質，Park等[20]研究發現，經α-半乳糖苷酶處理后的豬異種骨可以降低α-半乳糖表位，對于C57BL/6 α-半乳糖敲出的小鼠而言，這種抗原的減少可以顯著降低體液免疫反應。

可見，單純物理方式以及物理化學聯合的方式制備移植物均可獲得較為滿意的支架性能，較于單純化學方式制備的移植物有更好的生物相容性、骨誘導性等。新型制備方式的研發也為異種骨的制備提供了更多選擇，且取得了較好效果。

3　重組異種骨

以上所述傳統方式制備異種骨移植物的過程中，盡管降低了免疫原性，但也不可避免地影響到移植物的骨誘導性能，尚且無法達到臨床應用需求，更難以媲美自體骨。近年來對于異種骨移植，如何在提高力學性能的同時而又不影響其生物學性能、早期恢復肢體功能已成為主要研究方向[21]，其中的熱點又集中于重組異種骨，即將某些促進骨生長的因子、細胞等與已處理過的異種骨相結合而成復合物，以增加骨誘導成骨的能力。

3.1骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)最初是因其具有促進異位骨形成的能力而命名，為異種多功能生長因子，在肢體生長、軟骨內骨化、骨折早期及軟骨修復時表達，通過促進多功能間質細胞分化為成骨細胞和成軟骨細胞，對骨骼的再生修復和胚胎發育起重要作用。具有較廣闊臨床應用前景的是重組人BMP-2和BMP-7，較早應用于脊柱融合、骨缺損等的治療。

Yon等[22]用BMP-2緩釋組分承載于豬異種骨中制成新型復合，用于治療骨缺損，相較于使用單純豬異種骨的對照組，實驗組有更好的局部骨生成，尤以中央區顯著，表明BMP-2具有良好成骨效應。Long等[23]用豬異種骨復合BMP制成重組異種骨實驗表明，將其應用于修復兔橈骨大段骨缺損，此種復合骨保持了其天然孔架結構和成分，具有較強的生物力學性能和骨傳導性，可誘導大量間充質細胞增殖分化，增強骨修復能力。除此之外，重組人BMP(rhBMP)-7也被證實有助于骨生成和骨傳導，主要用于治療骨折不愈合[24]。3.2脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells， ASCs)是一種具有自我更新能力、擁有可塑性和多向分化潛能的多功能干細胞[25]，具有較強的成骨分化能力，可加速骨愈合，治療骨缺損[26]。

Wilson等[27]以下頜骨缺損達10 mm的豬為模型，將脂ASCs直接注入局部骨缺損部位和經耳靜脈注射作為實驗組，單純注射培養基為對照組，在術后2周和4周運用X線掃描、熒光顯微鏡檢查、CT等評估骨愈合情況，證實局部骨缺損直接注射ASCs組骨愈合更好，X線和CT結果示骨密度更高，表明ASCs可以促進骨愈合，其對治療骨缺損有一定潛能。Pelegrine等[28]將新鮮骨髓基質以及純骨髓單核細胞分別與異種骨支架結合，再用單純異種骨作為對照，用于修復兔的頂骨缺損，發現富含新鮮骨髓以及骨髓單核細胞的異種骨在促進骨生成方面均較對照組有明顯改善，尤以富含骨髓單核細胞的實驗組更為顯著，其礦化區域的組織形態定量分析較其余2組有更高百分比。可見，間充質干細胞是一種極具發展潛能的可用于促進骨缺損愈合的天然材料，其與異種骨的復合也是未來的研究方向。

目前而言，部分重組異種骨已在臨床中展開應用，為骨缺損治療提供新的選擇，其中以口腔醫學臨床應用較為廣泛，而整形外科相關報道較少。Lad等[29]研究者統計了美國2002—2011年脊柱融合術相關資料，以比較BMP重組異種骨與自體髂骨移植臨床應用趨勢，結果表明BMP重組異種骨移植因其可改善療效和縮短住院時間，臨床應用逐漸增加。Hesse等[30]將脫細胞小牛骨質與患者自體骨髓聯合培養形成復合異種骨，用以修復脛骨遠端骨缺損達72 mm的患者，并輔以髓內釘固定，患者術后6周即可行走，2年隨訪期內未見任何異常。

異種骨移植的臨床應用中目前也存在一定缺陷。Naohiro等統計了Scott and White Health Care System 2006—2012年行足踝重建手術患者的資料，以比較小牛異種骨與非異種骨(自體骨和同種異體骨)之間治療骨缺損術后愈合率的差異，發現移植術后48周非異種骨不愈合率僅為5%，而異種骨移植達58%，較后兩者明顯升高。

4　總結與展望

骨丟失、骨缺損的外科治療依然是重難點，已有眾多修復材料可供選擇。異種骨作為替代材料的一種，因其低成本、易于獲取、有良好的骨傳導和生物力學性能，并具備天然的三維孔架結構等特性而被廣泛關注，有成為理想骨移植材料的潛能。尤其是隨著異種骨衍生材料研究的進一步深入，復合異種骨的臨床應用逐漸展開，異種骨作為治療骨缺損方式之一逐漸得到重視和認可。但異種骨免疫原性的去除以及制備依然對異種骨研究提出了巨大挑戰。

[1]EINHORN T A. Enhancement of fracture-healing[J]. J Bone Joint Surg Am， 1995， 77(6): 940-956.

[2]VAN HEEST A， SWIONTKOWSKI M. Bone-graft substitutes[J]. Lancet， 1999， 353(Suppl 1):SI28-SI29.

[3]BLOKHUIS T J， CALORI G M， SCHMIDMAIER G. Autograft versus BMPs for the treatment of non-unions: what is the evidence?[J]. Injury， 2013， 44(Suppl 1): S40-S42.

[4]RAWLINSON N J. Morbidity after anterior cervical decompression and fusion. The influence of the donor site on recovery， and the results of a trial of surgibone compared to autologous bone[J]. Acta Neurochir (Wien)， 1994， 131(1/2): 106-118.

[5]BAUMHAUER J， PINZUR MS， DONAHUE R， et al. Site selection and pain outcome after autologous bone graft harvest[J]. Foot Ankle Int， 2014， 35(2): 104-107.

[6]CAMPANA V， MILANO G， PAGANO E， et al. Bone substitutes in orthopaedic surgery: from basic science to clinical practice[J]. J Mater Sci Mater Med， 2014， 25(10): 2445-2461.

[7]KNESER U， STANGENBERG L， OHNOLZ J， et al. Evaluation of processed bovine cancellous bone matrix seeded with syngenic osteoblasts in a critical size calvarial defect rat model[J]. J Cell Mol Med， 2006， 10(3): 695-707.

[8]MEYER S， FLOERKEMEIER T， WINDHAGEN H. Histological osseointegration of Tutobone: first results in human[J]. Arch Orthop Trauma Surg， 2008， 128(6): 539-544.

[9]ACCORSI-MENDONCA T， CONZ MB， BARROS TC， et al. Physicochemical characterization of two deproteinized bovine xenografts[J]. Braz Oral Res， 2008， 22(1): 5-10.

[10]NASO F， GANDAGLIA A， IOP L， et al. Alpha-Gal detectors in xenotransplantation research: a Word of caution[J]. Xenotransplantation， 2012， 19(4): 215-220.

[11]EZZELARAB M， AYARES D， COOPER D K. Carbohydrates in xenotransplantation[J]. Immunol Cell Biol， 2005， 83(4): 396-404.

[12]JOZIASSE D H， ORIOL R. Xenotransplantation: the importance of the Galalpha1，3Gal epitope in hyperacute vascular rejection[J]. Biochim Biophys Acta， 1999， 1455(2/3): 403-418.

[13]FENG W， FU L， LIU J， et al. The expression and distribution of xenogeneic targeted antigens on porcine bone tissue[J]. Transplant Proc， 2012， 44(5): 1419-1422.

[14]SUN J， WANG X， FU C， et al. A crucial role of IL-17 in bone resorption during rejection of fresh bone xenotransplantation in rats[J]. Cell Biochem Biophys， 2015， 71(2): 1043-1049.

[15]SEEBACH J D， COMRACK C， GERMANA S， et al. HLA-Cw3 expression on porcine endothelial cells protects against xenogeneic cytotoxicity mediated by a subset of human NK cells[J]. J Immunol， 1997， 159(7): 3655-3661.

[16]RIBEIRO T A， COUSSIRAT C， PAGNUSSATO F， et al. Lyophilized xenograft: a case series of histological analysis of biopsies[J]. Cell Tissue Bank， 2015， 16(2): 227-233.

[18]GO A， KIM S E， SHIM K M， et al. Osteogenic effect of low-temperature-heated porcine bone particles in a rat calvarial defect model[J]. J Biomed Mater Res A， 2014， 102(10): 3609-3617.

[19]CHO J S， KIM H S， UM S H， et al. Preparation of a novel anorganic bovine bone xenograft with enhanced bioactivity and osteoconductivity[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater， 2013， 101(5): 855-869.

[20]PARK M S， KIM T G， LEE K M， et al. Effects of reduction in the alpha-gal antigen on bony union: a model of xenobone graft using GalT knockout mouse[J]. Xenotransplantation， 2014， 21(3): 267-273.

[21]LIU G， ZHAO L， ZHANG W， et al. Repair of goat tibial defects with bone marrow stromal cells and beta-tricalcium phosphate[J]. J Mater Sci Mater Med， 2008， 19(6): 2367-2376.

[22]YON J， LEE JS， LIM HC， et al. Pre-clinical evaluation of the osteogenic potential of bone morphogenetic protein-2 loaded onto a particulate porcine bone biomaterial[J]. J Clin Periodontol， 2015， 42(1): 81-88.

[23]LONG B， DAN L， JIAN L， et al. Evaluation of a novel reconstituted bone xenograft using processed bovine cancellous bone in combination with purified bovine bone morphogenetic protein[J]. Xenotransplantation， 2012， 19(2): 122-132.

[24]REICHERT J C， CIPITRIA A， EPARI D R， et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones[J]. Sci Transl Med， 2012， 4(141): 141ra93.

[25]PITTENGER M F， MACKAY A M， BECK S C， et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science， 1999， 284(5411): 143-147.

[26]SAULNIER N， LATTANZI W， PUGLISI MA， et al. Mesenchymal stromal cells multipotency and plasticity: induction toward the hepatic lineage[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci， 2009， 13(Suppl 1): 71-78.

[27]WILSON S M， GOLDWASSER M S， CLARK S G， et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells enhance healing of mandibular defects in the ramus of swine[J]. J Oral Maxillofac Surg， 2012， 70(3): e193-e203.

[28]PELEGRINE A A， ALOISE A C， ZIMMERMANN A， et al. Repair of critical-size bone defects using bone marrow stromal cells: a histomorphometric study in rabbit calvaria. Part Ⅰ: use of fresh bone marrow or bone marrow mononuclear fraction[J]. Clin Oral Implants Res， 2014， 25(5): 567-572.

[29]LAD S P， NATHAN J K， BOAKYE M. Trends in the use of bone morphogenetic protein as a substitute to autologous iliac crest bone grafting for spinal fusion procedures in the United States[J]. Spine (Phila Pa 1976)， 2011， 36(4): E274-E281.

[30]HESSE E， KLUGE G， ATFI A， et al. Repair of a segmental long bone defect in human by implantation of a novel multiple disc graft[J]. Bone， 2010， 46(5): 1457-1463.

2015-08-25)

葉永杰，1312653816@qq.com

R687.3+4

A

10.11851/j.issn.1673-1557.2016.04.002