抗菌肽的分離純化研究進(jìn)展

袁慧坤 袁文華 刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

抗菌肽的分離純化研究進(jìn)展

袁慧坤 袁文華 刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

抗菌肽是抗生素的替代選擇之一，具有較高的抗菌活性和與抗生素不同的作用機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性。但是，天然抗菌肽的提取存在成本高、操作繁瑣等缺點，因此需要加強對新型抗菌肽的研究。本文主要對天然抗菌肽的優(yōu)勢、分離和純化步驟進(jìn)行綜述。

抗菌肽；分離純化；結(jié)構(gòu)測定

自1972-1975年從果蠅及惜古比天蠶中分離出天蠶素（Cecropin）以來，抗菌肽便受到廣泛的關(guān)注。抗菌肽（Antimicrobial Peptide）又被稱為肽抗生素（Peptide Antibiotics）。抗菌肽的來源廣泛，大多數(shù)生物體的自然防御系統(tǒng)內(nèi)均含有抗菌肽。抗菌肽對于已經(jīng)產(chǎn)生抗生素耐藥性的細(xì)菌具有有效的抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，所以抗菌肽成為具有極大研究潛力的物質(zhì)。

1 抗菌肽的抗菌優(yōu)勢

抗菌肽擁有的與傳統(tǒng)型抗生素不同的抗菌機(jī)制，使得抗菌肽具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗寄生蟲等病原體活性高和靶向點多、耐藥性低等優(yōu)勢。抗菌肽的肽鏈長度相對較短，一般為15～50個氨基酸殘基構(gòu)成，其分子量小，更易于快速到達(dá)感染部位。另外，抗菌肽可以不同功能類型聯(lián)合使用或與抗生素互相聯(lián)合發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，增強機(jī)體免疫能力。

2 抗菌肽的分離純化與結(jié)構(gòu)測定

分離純化是天然抗菌肽獲取過程中的一項重要環(huán)節(jié)，是進(jìn)一步對抗菌肽的人工合成與機(jī)理研究的基礎(chǔ)步驟。分離純化的過程復(fù)雜，對于未知成分和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌肽，其難度更大。分離純化的關(guān)鍵在于既要保持抗菌肽的生物活性，又要得到純的單一活性的肽。所以，在分離純化階段每操作一步都要對其抗菌活性進(jìn)行檢測，只有具備抗菌活性，才有必要進(jìn)行接下來的試驗，從而得到理想的單一活性肽。

2.1 純化前處理

在分離純化步驟前，要注意對樣品的前處理：若抗菌肽存在于體積偏大的有機(jī)體內(nèi)的組織或器官，應(yīng)在提取前將其按照不同組織或器官分類；若抗菌肽存在于機(jī)體偏小至難分割狀態(tài)時，要使整個機(jī)體作為提取的對象。同時，要注意對干燥溫度、儲藏時間等因素的調(diào)控，以防對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2 分離純化

2.2.1 分離純化的步驟。抗菌肽的分離純化基本都是根據(jù)抗菌肽的兩親性、帶正電荷和分子量小的特性進(jìn)行。另外，抗菌肽的純度與上樣量和層析柱等均有關(guān)系。目前的分離純化步驟可歸納為以下3步［1］：①使用高速離心或者超濾的方法除去樣品中的大分子蛋白質(zhì)、脂肪和顆粒物；②使用分子篩、固相萃取、離子交換色譜等方法去除部分較大分子蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和脂肪等干擾物，進(jìn)一步分離提取得到分子量比之更小的成分；③將濾液通過陽離子交換層析、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離純化活性物質(zhì)。

2.2.2 分離純化的方法。抗菌肽的分離純化方法主要有：依據(jù)溶解性能差別分離，可將其分為低溫有機(jī)溶劑沉淀、鹽析法等；根據(jù)分子大小的不同分離，可將其分為超濾、透析和凝膠過濾等；根據(jù)配體特異性分離，如親和層析法［2］等。研究表明，大部分的分離純化是根據(jù)多肽類的理化性質(zhì)而采用多級純化方法和多種分離方法結(jié)合使用。陳玉清等［3］通過Sephadex G-100凝膠過濾層析和CM-Sepharose CL-6G離子交換層析及HPLC分離，在家蠶幼蟲免疫血淋巴內(nèi)分離出2種抗菌蛋白。

2.3 抗菌肽結(jié)構(gòu)測定方法

2.3.1 非質(zhì)譜技術(shù)。如今，N端測序法是應(yīng)用于氨基酸序列的主要測定方法。雖然N端測序法已被廣泛應(yīng)用于氨基酸測序中，但存在一個弊端，就是位于N端的多肽或蛋白質(zhì)無法被測定。此時，可以使用脫修飾反應(yīng)，使得N端的氨基酸序列暴露出來進(jìn)行測定。而且，Edman降解是N端測定法的基礎(chǔ)，較小的肽段是無法被Edman講解法測定出全序列的。所以，其靈敏度較低，不適合應(yīng)用于高通量分析中。

2.3.2 質(zhì)譜技術(shù)。近年來，質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，針對分子量相對較小的蛋白開發(fā)出了4種測定技術(shù)：電噴霧、離子體解吸、基質(zhì)輔助激光解吸／電離和快原子轟擊。而納升電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，使得測定微量蛋白質(zhì)的領(lǐng)域得到巨大提升。電噴霧質(zhì)譜測度的原理是肽段通過與惰性氣體不斷碰撞，誘導(dǎo)分裂而衍生出的一系列碎片離子，通過他們的質(zhì)量差推斷所需測定的氨基酸序列。納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜就是安裝一系列納升噴霧源在四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF2）上，該方法的優(yōu)點是可以使翻譯后的氨基酸純度及修飾不能夠制約抗菌肽的序列測定。使離子阱電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜或三四級電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜與其比較可知，四級桿-飛行時間電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-ESI-Ms/Ms）的靈敏度和分辨率要高一些，質(zhì)量測定的準(zhǔn)確度同樣較高。所以，四級桿-飛行時間電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜更佳適用于抗菌肽的測序，更有益于獲得準(zhǔn)確度高的數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜軟電離技術(shù)在進(jìn)行蛋白質(zhì)測定時，所產(chǎn)生分子相對穩(wěn)定，方法有效，因此受到眾多領(lǐng)域的重視，不僅在蛋白質(zhì)序列測定上，還在有機(jī)化學(xué)、藥學(xué)和高分子化學(xué)上發(fā)揮巨大潛力，成為眾多研究學(xué)者分析分子純度、質(zhì)量的有效工具。

3 展望

天然抗菌肽針對致病菌的入侵和免疫功能的調(diào)節(jié)均有顯著功效，并且其廣譜抗細(xì)菌、無免疫源性和分子量小等功效均有待開發(fā)，其毒副作用等無明確闡述，仍需要不斷優(yōu)化抗菌肽的分離提純等技術(shù)，不斷加深對抗菌肽的研究和探索。

抗菌肽在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥方面表現(xiàn)出很大的潛力價值，但若是將其投入畜牧業(yè)，開始大規(guī)模生產(chǎn)仍存在很多待解決的問題，如從自然物質(zhì)中提取抗菌肽是一個相對來講比較復(fù)雜的過程，來源受限，分離純化步驟繁瑣，投入高是回報率低。所以，想要讓抗菌肽更廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域，仍需要進(jìn)一步研究其副作用、相互作用及各個環(huán)節(jié)。

［1］苗建銀，柯暢，郭浩賢，等.抗菌肽的提取分離及抑菌機(jī)理研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品科技，2014（13）：203-240.

［2］韓金玉，那平，元英進(jìn).親和色譜純化蛋白質(zhì)新進(jìn)展［J］.色譜，1996（6）：447.

［3］陳玉清，李保存，吳希，等.家蠶抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分離純化及性質(zhì)鑒定［J］.南京師大學(xué)報（自然科學(xué)版），2006（3）：103-107.

TS201.2

A

1674-7909（2016）36-43-2

袁慧坤（1993-），女，碩士，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。

刁新平，副教授，碩士生導(dǎo)師。