高效液相色譜法測定乳粉中維生素K1的改進

（華測檢測認證集團上海華測品標檢測技術有限公司，上海 201206）

高效液相色譜法測定乳粉中維生素K1的改進

邵艷，翟立斐，王煥新，柴平海

（華測檢測認證集團上海華測品標檢測技術有限公司，上海 201206）

建立了固相萃取-高效液相色譜法分析乳品中維生素K1的方法。樣品經磷酸鹽緩沖液和脂肪酶酶解，正己烷提取和三氧化二鋁柱純化后，以正己烷定容，以Eclipse XDB C8色譜柱（配柱后鋅粉衍生柱）分析，溶解了10 mmol氯化鋅、5 mmol乙酸鈉和5 mmol冰醋酸的甲醇為流動相，在0.8 mL/min的流速下，激發波長243 nm，發射波長：430 nm檢測。維生素K1的加標回收率為86.4% ～ 92.6%，變異系數為1.3%～2.4%，線性范圍為0.05～10.0 μg/mL，相關系數為0.9994，方法的檢出限為10 μg/kg。該方法線性范圍廣，靈敏度高，凈化效果好，可滿足實際樣品分析的需求。

脂肪酶；固相萃取；高效液相色譜；XDB C8色譜柱；維生素K1

0 引言

維生素K1是一種萘醌衍生物，化學名稱為2-甲基-3-（3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯基）-1，4-萘醌。維生素K1能控制血液凝結，因此在臨床上將維生素K1廣泛應用于凝血酶過低、維生素K1缺乏癥、新生兒自然出血癥的防止[1]。維生素K1是脂溶性的物質，對熱、氧及水分的作用很穩定，但在堿性環境下，受陽光照射會分解[2]。目前維生素K1的檢測方法主要有電極法[3]、毛細管電泳法[4]、高效液相色譜法[5-8]。一般維生素K1測定所使用的前處理酶解方法，在液相色譜圖中目標峰的前面有一個很大的干擾峰，且出峰時間長。本研究優化前處理方法，采用常規的甲醇溶液為流動相，建立了應用C8色譜柱和鋅粉柱后衍生柱對維生素K1的高效液相色譜分析方法。

1 實驗

1.1材料與試劑

標準物質：維生素K1（99.0%）；甲醇（色譜純）；冰醋酸（色譜純）；正己烷（色譜純）；脂肪酶（酶活力≥700 U/mg）；中性氧化鋁柱（500 mg/6 mL）其他試劑無水乙醇、氯化鋅、氫氧化鈉、無水硫酸鈉等均為國產分析純。

1.2儀器與設備

高效液相色譜儀，帶FLD檢測器；色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C8，5 μm 4.6×150 mm）；鋅粉衍生柱（50 mm×4.6 mm，鋅粉50 ～70 μm）；高速離心機；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋；旋轉蒸發儀（EYELA OSB-2100）；電子天平（AL204）；渦旋混合器（WH-861）。

1.3方法

1.3.1 標準溶液的配制及標準曲線

標準儲備液：準確稱取50 mg維生素K1于25 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容，配制成質量濃度為2 000 μg/mL，-18℃儲存備用[6]。根據需要濃度用正己烷稀釋成20 μg/mL工作液。

標準曲線配制：分別吸取0.1，0.2，0.5，0.8和1.0 mL標準工作液；用正己烷定容至10 mL，配制成質量濃度分別為0.20，0.40，1.00，1.60和2.00 μg/mL的標準溶液系列。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.5 g奶粉于50 mL塑料離心管中，加入25 mL磷酸鹽緩沖液（45 ～50℃，1.39 g磷酸二氫鈉和1.28 g磷酸氫二鈉溶解定容到500 mL），1.0 g脂肪酶，于37℃±5℃水浴振蕩器中過夜。取出樣液，加2 mL氫氧化鈉溶液（濃度10 mol/L），用50 mL乙醇溶液轉移入250 mL分液漏斗中，用100 mL正己烷分兩次萃取（必要時加飽和氯化鈉溶液去乳化）。合并的有機相真空旋蒸干，用2 mL正己烷溶出，在0℃以下冷凍1 h以上，高速離心后，上清液過中性氧化鋁柱，用1.5 mL石油醚淋洗，4 mL正己烷洗脫接收到10 mL試管中（控制流出速度，1滴/3 s）。洗脫液置氮吹儀上于40℃±2℃下吹干后，用1 mL正己烷定容，再經0.22 μm微孔濾膜過濾，供檢測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C8，5μm4.6×150mm，鋅柱（50 mm×4.6 mm）；流速為0.8 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30℃；流動相為甲醇溶液（10 mmol氯化鋅、5 mmol乙酸鈉和5 mmol冰醋酸）；熒光檢測波長為激發波長243 nm，發射波長430 nm。

2 結果與分析

2.1前處理條件的選擇

實驗中發現用脂肪酶酶解時，加入磷酸鹽緩沖液[9]后，目標峰前面的干擾峰變小。有文獻介紹[10]，胰脂肪酶的酶解效果不錯，但是價格昂貴，出于對檢測成本考慮，本研究還是采用脂肪酶酶解，然后再用氧化鋁柱純化，干擾峰明顯變小。

2.2色譜柱的選擇

一般文獻資料里介紹都采用C18柱進行維生素K1的測定。由于維生素K1側鏈上有四個異戊二烯殘基，所以在C18柱上保留強，導致出峰時間很長，因此采用了C8柱進行了優化。維生素K1在Eclipse XDB-C8色譜柱上的保留時間在6 min左右，而以同樣的流速和甲醇溶液流動相，維生素K1在Eclipse XDB-C18色譜柱上的保留時間在15 min左右，峰型也不好，應用C8柱大大縮短了分析檢測時間。

2.3流動相和流速的選擇

GB 5413.10-2010中測定維生素K1，流動相中加入的二氯甲烷，大量長期使用對儀器有損害，本實驗只用甲醇溶液做流動相進行色譜分析，保留時間為5.8 min，流速0.8 mL/min時達到了合適的保留時間、峰型以及分離效果.

2.4繪制標準曲線

標準系列各進樣10 μL，得到維生素K1的色譜圖，以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并對曲線進行線性回歸。該方法在質量濃度為0.05 ～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好。回歸方程及相關系數如表1所示。

表1 維生素K1的回歸方程和相關系數

圖1 標準曲線

2.5樣品分析和檢出限

將標準品、加標樣品按照方法進行測定，得到其色譜圖（圖2和圖3）。樣品的檢出限為10 μg/kg。

圖2 標準色譜

圖3 加標樣品色譜

2.6回收率、精密度

在奶粉中分別加入10，20，100 μg/kg三個不同質量分數的標準品；分別進行6次平行實驗，得到方法的回收率和精密度如表2所示。

表2 方法回收率和精密度（n=6）

3 結 論

本文建立了高效液相色譜法測定乳粉中的維生素K1。采用固相萃取柱凈化，Eclipse XDB C8柱進行高效液相色譜分離，熒光檢測器測定。實驗結果表明，采用脂肪酶酶解后氧化鋁柱純化，對于乳粉有較好的凈化效果，應用C8柱大大縮短了樣品檢測的時間。實驗證明，該方法快捷，結果準確，適用于實驗室對乳粉中維生素K1的檢測。

[1]王昂，王麗麗，蔣沁，等.維生素K的生產及應用研究[J].河北化工，2008，31（9）：35-37.

[2]聶洪勇.維生素及其分析方法[M].上海：科學技術文獻出版社，1987.

[3]陳松林，韓紫巖，丁彥庭.修飾電極技術在維生素K1含量測定中的應用[J].河南大學學報，2003，22（3）：28-29.

[4]梁紅艷，溫潔，姜曉峰.利用毛細管電泳測定血清中維生素K的含量[J].中國實驗診斷學，2003，7（2）：87-89

[5]HARVY E，DAVID C.W.Determination of Vitamin K in Milk and Infant Formulas by Liquid Chromatography；Collaborative Study[J].J. Aoac.Int.，2000，83（1）：121-130.

[6]HIROSHI I.Determination of vitamin K1in emulsified nutritional supplements by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography with postcolumn reduction on a platinum catalyst and fluorescence detection[J].J.chromatogra.A，2008，881（1-2）：261-266.

[7]GB 5413.10-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測定[S].

[8]王竹，王光亞.蔬菜中維生素K1的測定-HPLC法[J].Acta Nutri?menta Sinica，1999，21（4）：450-453.

[9]鄧峰，周英田，吳小紅.高效液相色譜法對食品中維生素K1的定量測定[J].色譜，1996，14（3）：233-234.

[10]姜瑞清，周琳，胡桂林，等.對GB 5413.10-2010中維生素K1檢測的改進研究[J].中國乳品工業，2011，39（9）：50-52.

Improvement research on the determination of Vitamin K1in milk using High Performance Liquid Chromatography

SHAO Yan，ZHAI Li-fei，WANG Huan-xin，CHAI Ping-hai
（Shanghai PinBiao Company of Centre Testing International（shenzhen）Corporation，Shanghai 201206，China）

An analytical method was developed for the determination of Vitamin K1in milk by solid phase extraction-high performance liq?uid chromatography.The sample was enzymatic hydrolysis by lipase in phosphate buffer solution，extracted with hexane，and then the extract was purified with aluminium oxide column，and finally，Vitamin K1was stored in hexane solution.The separation was achieved by using Eclipse XDB C8 column and an elution with the mobile phases of methanol dissolving 10 mmol Zinc chloride，5 mmol sodium acetate and 5 mmol glacial acetic acid.The identification and quantitative analysis were carried out with fluorescence detector at excitation 243nm and emission 430 nm with flow rate 0.8 mL/min.The recoveries ranged from 86.4%to 92.6%with the relative standard deviations(RSDs）be?tween 1.3%and 2.4%.The linear range was 0.05 ～10.0 μg/mL and the correlation coefficient（r2）was 0.9994.The limit of detection was 10 μg/kg.The method is enough for the analysis of Vitamin K1in actual samples with wide linear range and high sensitivity.

lipase;solid phase extraction;High Performance Liquid Chromatography spectrometry;XDB C8 chromatography column;Vitamin K1

TS252.7

A

1001-2230(2016)11-0057-02

2016-03-30

邵艷（1975-），女，碩士，研究方向為食品檢測分析。