磷酸二酯酶5基因在腎癌組織中表達情況的研究

潘曉波，王雪，任雨，翁國斌

磷酸二酯酶5基因在腎癌組織中表達情況的研究

潘曉波，王雪，任雨，翁國斌

目的探討磷酸二酯酶5（PDE5）基因在腎癌組織中的表達情況。方法采用RT-qPCR和Westernblot實驗檢測45例腎癌及其癌旁組織中PDE5基因的表達水平。結果腎癌PDE5/癌旁PDE5的mRNA陽性表達相對Ct值為（1.65±0.1189），差異有統計學意義（＜0.01）；腎癌PDE5/癌旁PDE5的蛋白陽性表達的相對灰度值為（2.664±0.3419），差異有統計學意義（＜0.01）。結論PDE5基因在腎癌的發生發展中可能起重要作用。

磷酸二酯酶5；腎腫瘤；癌

腎癌是泌尿系統較常見的惡性腫瘤之一，目前手術切除仍是主要的治療手段。近些年分析腎癌的生物學特性，探索其治療的新途徑成為了臨床關注的熱點。有研究發現磷酸二酯酶5（PDE5）在某些腫瘤如結腸癌、膀胱癌及乳腺癌等腫瘤中呈強陽性表達且活性明顯增加進而調控腫瘤細胞凋亡，由此推測PDE5在腫瘤的發生發展中起到重要作用。然而，PDE5在腎癌中的表達情況還不清楚，因此，本研究采用RT-qPCR、Western blot實驗研究PDE5基因在腎癌組織中的表達情況，為今后腎癌的臨床治療尋找新靶點提供理論依據。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集寧波大學醫學院附屬鄞州醫院2011—2015年手術切除的腎癌組織45例，術前均未行放化療，標本均于術后立即取材并保存在液氮中。選取距腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁組織作對照。其中男27例，女18例；年齡28～82歲，平均（56.99±4.98）歲；按AJCC標準進行病理分期：T1～T2 32例，T3～T4 13例；按TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期16例；分化程度：高分化9例，中分化31例，低（未）分化5例；腫瘤直徑：≥4cm者19例，＜4cm者26例。

1.2檢測方法

1.2.1RT-qPCR實驗檢測PDE5mRNA在不同組織中的表達。分別取腎癌組織及癌旁組織，采用TrizolReagent試劑盒（Invitrogen，美國）提取細胞總RNA，測量RNA濃度，然后應用逆轉錄試劑盒（Toyobo，日本）進行逆轉錄合成cDNA。合成后的cDNA進行聚合酶鏈反應（Toyobo，日本），肌動蛋白（B-actin）作內參對照。根據PDE5及B-actin基因序列設計引物為：PDE-5正向5’-CACACCGAATCTTGCTCTTG-3’，反向5’-TCAGAATCCTTGACAACAATGG-3’，擴增產物134 bp；B-actin正向5’-AATCGTGCGTGACATTAAG-3’，反向5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’，擴增產物178bp。定量的方法參照文獻［1］，以Ct法表示基因的表達量。

1.2.2Western blot實驗檢測PDE5蛋白在不同組織中的表達量。將腎癌組織及癌旁正常組織用組織蛋白提取液勻漿后，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，溶解于冰浴PBS緩沖液（0.lmol/LTris-HCl，pH 8.0、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1％乙基苯基聚乙二醇、0.5％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS、0.1％蛋白酶抑制劑混合物、10mmol/LPMSF），30 min。4℃下21 000 r/min離心30min，離心收集上清液，Bradford法檢測蛋白濃度，取溶于緩沖液中的20 mg蛋白質行12％SDSPAGE電泳，轉PVDF膜上，加入相應抗體進行免疫印記。由ECL試劑盒（碧云天生物技術研究所）完成檢測，應用Quantity One 4.4軟件處理分析。

1.3統計方法采用SPSS19.0統計軟件處理數據。計量資料以均數±標準差表示，兩組比較用檢驗，計數資料比較用2檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PDE5 mRNA在腎癌及癌旁組織中的表達情況134 bp（PDE5）及178 bp （B-actin）處均有單一特異性條帶，134bp處的條帶腎癌組較癌旁組織組明顯（封三彩圖2A），腎癌組織中的PDE5 mRNA表達明顯高于癌旁組織（封三彩圖2B），差異有統計學意義（=5.323，＜0.05）。

2.2PDE5蛋白在腎癌及癌旁組織中的表達情況腎癌及癌旁組織組織內均有PDE5蛋白表達，蛋白條帶位置為105 kDa（封三彩圖3A）。蛋白條帶灰度值分析表明，PDE5蛋白在腎癌組織中表達較癌旁組織明顯增高（封三彩圖3B），差異有統計學意義（=4.869，＜0.05）。

3　討論

PDE5是環核苷酸水解酶超家族的成員之一，可以特異性水解細胞內第二信使cGMP［2］，最早從大鼠的肺中提純出來［3］，后在1993年首次被克隆［4］。PDE5主要分布于大腦、陰莖海綿體、血管平滑肌細胞、肺及血小板等［5］，主要是調節平滑肌的收縮，同時在大腦內cGMP信號傳遞上起到重要的作用［6］。

國內外研究證實，PDE5在結腸癌、膀胱癌及乳腺癌中高表達且活性增加［7-8］，但其在人腎癌組織中的表達情況如何，目前尚未見報道。本研究顯示PDE5在腎癌組織中的表達較癌旁組織高（＜0.05），提示其可能在腎癌的發生發展中起重要作用。研究發現PDE5抑制劑對多種腫瘤細胞具有抑制作用，有研究發現PDE5在甲狀腺腫瘤中高表達，應用西地那非阻止了腫瘤細胞的生長及轉移［9-10］。Kwon等［11］報道，PDE5抑制劑提高了結腸癌細胞內cGMP濃度，激活了下游的PKG，進而抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡。Ren等［12］通過轉染表達PDE5特異性的反義序列的載體于人腎癌OSRC2細胞，PDE5基因表達減少，促進了細胞凋亡，研究表明cGMP/PKG信號傳導通路在調節腎癌細胞的增殖和存活方面起著重要的作用。由此可見，PDE5抑制劑可以抑制細胞內cGMP的特異性水解，提高腫瘤細胞內濃度，激活下游PKG，使細胞增殖抑制，發揮抗凋亡作用。本研究發現PDE5在腎癌組織中也呈高表達，因此推測cGMP/PKG信號傳導通路在腎癌的發生發展中起重要作用，但具體作用機制尚需研究，為進一步研究腎癌的發生發展機制提供理論依據，同時為探索腎癌治療新途徑提供實驗基礎。

［1］LivakKJ，SchmittgenTD.Analysisofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2（-Delta Delta C （T）method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［2］Zhu B，Strada SJ.The novel functions of cGMP-specific phosphodiesterase 5 and itsinhibitorsincarcinomacellsandpulmonary/cardiovascular vessels［J］.Curr Top Med Chem，2007，7（4）：437-454.

［3］FrancisSH，LincolnTM，CorbinJD.Characterization o f a novel cGMP bindingproteinfromratlung［J］.JBiolChem，1980，255 （2）：620-626.

［4］McAllister-Lucas LM，Sonnenburg WK，Kadlecek A，et al.The structure obovine lung cGMP-binding，cGMP-specific，phosphodiesterase，deduced，from，cDNA，clone ［J］.JBiolChem，1993，268（268）：22863-22873.

［5］Keravis T，Lugnier C.Cyclic nucleotide phosphodiesterase（PDE）isozymes as targets of the intracellular signalling network：benefits of PDE inhibitors invarious diseases andperspectivesforfuture therapeuticdevelopments［J］.J Pharmacol，2012，165 （5）：1288-1305.

［6］Bender AT，Beavo JA.Cyclic nucleotide phosphodiestemses：molecular regulation to clinical use［J］.Pharmacol Rev，2006，58 （3）：488-520.

［7］ThompsonWJ，PiazzaGA，LiH，etal.Exisulindinductionofapoptosisinvolvesguanosine 3'，5'-cyclic monophosphate phosphodiesteraseinhibition，proteinkinaseGactivation，and attenuatedbeta-catenin［J］.CancerRes，2000，60（13）：3338-3342.

［8］Tinsley HN，Gary BD，Keeton AB，et al. InhibitionofPDE5bysulindac sulfideselectively induces apoptosis and attenuates oncogenic Wnt/beta-catenin-mediated transcriptioninhumanbreasttumorcells［J］.CancerPrevRes（Phila），2011，4（8）：1275-1284.

［9］Tinsley HN，Gary BD，Keeton AB，et a1. Sulindac sulfidese-lectively inhibits growth andinducesapoptosisofhumanbreas tumor cells by phosphodiesterase 5 inhibition.elevationofcyclicGMP，andactivationofproteinkinase G［J］.Mol Cancer ther，2009，8（12）：3331-3340.

［10］SponzielloM，Verrienti A，Rosignolo F，et a1.PDE5expressioninhumanthyroidtumors and effects of PDE5 inhibitors on growthandmigrationofcancercells［J］.Endocrine，2015，50（2）：434-441.

［11］Kwon IK，Wang R，Thangaraju M，et al. PKG inhibits TCF signaling in colon cancer cellsbyblocking beta-catenin expression andactivatingFOXO4［J］.Oncogene，2010，29（23）：3423-3434.

［12］RenY，ZhengJ，YaoX，etal.Essentialrole ofthecGMP/PKGsignalingpathwayinregulatingtheproliferationandsurvivalofhuman renalcarcinomacells［J］.International Journal ofMolecularMedicine2014，32（1/2）：293-294.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.009

R737.11

A

1671-0800（2016）08-0997-02

2016-01-25

（本文編輯：孫海兒）

315040寧波，寧波大學醫學院附屬鄞州醫院

潘曉波，Email：179571095 @qq.com