IL-4及IL-9在D-IBS患者外周血中的表達及其與腸道MC活化的關系

沈敏瑾

IL-4及IL-9在D-IBS患者外周血中的表達及其與腸道MC活化的關系

沈敏瑾

目的 通過入組腹瀉性腸易激綜合征（D-IBS）患者，觀察外周血中IL-4及IL-9的表達及腸道肥大細胞（MC）活化情況。方法 依據羅馬III診斷標準入選D-IBS患者30例，健康對照組30例，采用甲苯胺藍染色法計數回盲部結腸黏膜MC，ELISA法檢測血清中IL-4、IL-9表達。結果 與正常對照組比較，IBS患者MC數量增多（4.43±0.21 vs 2.12±0.27）（P＜0.05），黏膜IL-4及血清IL-9的表達均高于對照組（42.76±5.71 vs 21.19±6.17，30.43±7.45 vs 26.74±5.12）（P＜0.05）。結論 D-IBS患者血清中存在IL-4、IL-9的表達升高，其可能通過促進MC活化脫顆粒，從而引起IBS臨床癥狀。

腸易激綜合征 肥大細胞 白介素4 白介素9

腸易激綜合征（IBS）是最常見的功能性胃腸病，全球范圍內IBS發病率波動在3.3%～31.6%，目前亞洲國家IBS發病率已達9.6%［1］。據臨床表現，IBS可進一步分為腹瀉型、便秘型及混合型，其中以腹瀉型居多。內臟高敏感是IBS癥狀產生的主要原因，但其具體產生機制至今尚未清楚闡明。目前，肥大細胞（MC）在IBS中的重要作用已被肯定［2］，白介素4（IL-4）及白介素9（IL-9）與MC活化密切相關，但是其在IBS中的相關研究較少。在本研究中，作者通過檢測腹瀉型IBS（D-IBS）患者與健康人群外周血中IL-4及IL-9表達水平及腸道MC活化情況，擬初步探討IL-4及IL-9介導MC活化在IBS發病中的作用。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2015年6月至12月在本院消化科住院及門診就診的D-IBS患者30例（觀察組），其中男13例，女17例，平均年齡（43.2±12.6）歲。均符合羅馬III中D-IBS診斷標準［3］：反復發作腹痛或腹部不適，且近3個月內≥3d/1個月，且伴有以下≥2條：排便后緩解；發作時伴排便次數的改變；發作時伴排便性狀的改變。診斷前癥狀出現≥6個月，最近3個月有典型的癥狀發作。D-IBS亞型：稀/水樣便＞25%，且塊狀/硬便＜25%。須經腸鏡等檢查排除引起這些癥狀的器質性疾病。所有患者需排除任何已知的食物不耐受，吸收不良，有胃腸道手術史，器質性胃腸道疾病當前診斷或病史。選取同期健康體檢者30例（對照組），其中男12例，女18例，平均年齡（40.2±14.1）歲。所有患者均簽署知情同意書。兩組性別、年齡及BMI各亞型之間比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）標本采集：收集D-IBS患者及健康對照者空腹靜脈血5ml，2500r/min，離心5min。分離血清后置于-80℃冰箱保存備用。腸鏡檢查中獲取回盲部活檢組織2塊，用生理鹽水清洗干凈，分別浸泡入10%中性福爾馬林中或液氮中。（2）血清IL-4及IL-9檢測：采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清IL-4及IL-9表達，人IL-4試劑盒購自美國eBioscience公司，人IL-9試劑盒購自美國GUSABIO公司，操作嚴格按照說明書進行，在0孔內加入100μl標準稀釋液，留3孔不加為空白孔。標準孔內加入標準品50μl/孔。試驗孔內加入生物素標記的抗IL-4或抗IL-9 50μl/孔，室溫孵育2h，洗板3次。加入鏈霉素標記的HRP工作液100μl/孔，室溫孵育30min，洗板3次。加入100μl色素底物液100μl/孔，孔內液體將會變為藍色。室溫避光孵育30min。加入終止液100μl/孔，緩慢混勻。孔內液體將會由藍色變為黃色。在加入終止液2h內在酶標儀上檢測各孔吸光度（OD值）。通過標準曲線作圖分析計算樣品濃度。（3）腸道MC甲苯胺藍染色：采用10%中性福爾馬林固定新鮮標本，系列脫水、透明后石蠟包埋，4μm連續切片，75℃烤30min，常規脫蠟至水；滴加甲苯胺藍液反應30min；水洗，入冰醋酸液分化，至胞核和顆粒清晰；水洗，用冷風吹干；二甲苯透明，中性樹膠封固。然后于顯微鏡下觀察課件MC胞質顆粒呈紅紫色，胞核呈藍色。每個樣本取隨機5個高倍視野（×200），連續計數并取平均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩個樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血中IL-4及IL-9的表達水平比較 與對照組比較，D-IBS患者血清IL-4的表達顯著升高（42.76±5.71） vs （21.19±6.17）（P＜0.05），同時，血清IL-9的表達亦上調（30.43±7.45） vs （26.74±5.12）（P＜0.05）。

2.2 回盲部MC計數比較 MC主要分布于疏松結締組織，外形多呈橢圓形，胞核藍色，胞質內可見紫紅色顆粒，部分可見胞內顆粒釋放現象（見圖1）。與正常對照組比較，D-IBS患者MC數量明顯增多（4.43±0.21） vs （2.12±0.27）（P＜0.05）。

圖1 兩組MC HE染色圖

3 討論

腸道MC活化是IBS人群重要特征之一［4］，研究發現，在IBS人群中，小腸及大腸MC分布均增多，進一步研究發現，MC的分布受性別［5］、不同腸段［6］及IBS亞型影響，其中，與便秘型IBS比較，D-IBS患者腸道MC分布更多［7-8］。MC活化后可以脫顆粒釋放一系列炎癥因子，如蛋白酶、前列腺素、組胺、細胞因子等，研究發現，IBS患者腸道中MC分布更靠近腸神經末梢，并且與內臟痛覺過敏密切相關［9］。進一步研究發現，MC釋放的相關物質可以活化腸神經元［10］，其中，多種細胞因子，如IL-6、IL-8、TNF-α等可以調控腸道動力及腸道感覺神經元，參與IBS癥狀的產生［11］。在本研究中，D-IBS患者回盲部MC數量增多，與前期研究結果一致。

多種途徑參與介導MC活化，一般認為，當MC偶聯交聯有特異性抗原的IgE/IgG，或者游離免疫球蛋白輕鏈（IgFLC）后，自身可以被激活。此外，MC的活化尚與包括補體、神經遞質、激素等在內多種物質有關。在IBS發病中，研究認為，來源于腸腔的食物抗原、致病菌等可以通過經典途徑引起MC活化［12］，而中樞應激則主要通過釋放CRF參與介導MC活化。除此之外，已證實多種細胞因子與MC活化有關，但是其在IBS發病中的作用尚不清楚。

IL-4與MC的活化密切相關：IL-4的表達上調可以引起抗原特異性IgE產生，從而導致MC活化。目前，有關IBS外周血IL-4表達情況的相關臨床研究較少，有研究認為，作為TH2類細胞因子，IL-4在IBS患者外周血表達與正常對照組比較無明顯變化，然而，在基礎研究方面，有文獻報道，采用旋毛蟲灌胃構建感染后腸易激綜合征（PI-IBS）小鼠模型并檢測腸道中IL-4的表達，結果發現其在腸道急性感染期表達上調，而隨后表達恢復正常甚至降低，提示IL-4通過活化MC可能在IBS早期發揮作用。此外，近期有研究發現，腸道中樹突狀細胞活化可以通過刺激T淋巴細胞分泌IL-4，其可能通過活化MC參與IBS大鼠內臟高敏感的產生。在本研究中，D-IBD患者腸道中存在MC數量增多，同時伴隨有外周血表達IL-4上調，提示IL-4通過活化MC可能在IBS的發生中發揮重要作用。

IL-9最初被認為是一種T淋巴細胞生長因子，從其細胞來源分析，包括Th2類細胞、Th9細胞、Th17細胞、Treg細胞及其MC等在內的多種細胞均可以分泌IL-9，其中，MC是分泌IL-9的主要細胞類型，其可以通過自分泌的形式增加MC表面FceRIα的表達，促進細胞表面IgE交聯，啟動下游信號，從而引起MC活化并脫顆粒釋放組胺等炎性介質，形成正反饋進一步促進IL-9分泌，從而促進免疫應答中MC的生長和增殖。目前，有關IL-9與IBS關系目前未見報道，本研究發現，D-IBS患者外周血中IL-9表達顯著升高，并且伴隨有腸道MC數量增加，提示D-IBS患者中，可能存在IL-9-MC-IL-9的正反饋調節方式，IL-9本身是引起MC活化的主要因子，而MC活化后，又進一步促進IL-9的分泌。

綜上所述，D-IBS患者外周血IL-4及IL-9表達上調，并伴隨有腸道MC數量增多，提示IL-4及IL-9介導的MC活化可能在D-IBS發病中發揮重要作用。當然，本研究尚存在的不足之處：僅觀察D-IBS患者外周血中IL-4及IL-9的表達水平，而腸黏膜中相關細胞因子的表達變化并未檢測，且其對象僅為D-IBS患者，MC相關細胞因子在IBS其他亞型中的表達變化尚需要更深入的研究進行探討。

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Objective To investigate the level of serum IL-4 and IL-9 in D-IBS patients as well as the number of MC in colon. Methods 30 D-IBS patients according to Rome III diagnostic criteria were enrolled in the study，and 30 healthy individuals as a normal control. Toluidine blue staining was used to determine the number of mast cells（MCs）. Expression of IL-4 and IL-9 in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results The number of colonic MC in D-IBS group was more than that in control group（4.43±0.21vs2.12±0.27）（P＜0.05）. Expression of serum IL-4 and IL-9 in D-IBS group were higher than that in control group（42.76±5.71 vs21.19±6.17，30.43±7.45 vs26.74±5.12）（P＜0.05）.Conclusions The hypothesis was supported that the increased expression of serum IL-4 and IL-9 may lead to mast cells degranulation，which resulting in the clinical symptoms of D-IBS.

Irritable bowel syndrome Mast cell Interleukin-4 Interleukin-9

321000 浙江省金華市中心醫院消化科