三七對大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表達的影響

王雁彬，李廷荃，化金鳳，張曉園

三七對大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表達的影響

王雁彬1，李廷荃2，化金鳳1，張曉園1

目的 研究三七對大鼠下肢缺血后毛細血管密度(MVD)及血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法 選取雄性SD大鼠60只，體重250 g～300 g，隨機取20只為假手術組，僅暴露股動脈但不結扎股動脈及其分支；其余40只均采用左下肢股動脈結扎及分支剔除術，造成大鼠下肢缺血模型，造模后隨機分為模型組和三七組。分別在術后3 d、14 d后用免疫組化法測定缺血組織微血管密度和VEGF蛋白相對表達量。結果 三七組在術后3 d及14 d的MVD值高于假手術組(P<0.05)；與模型組比較，三七組術后3 d MVD值差異無統計學意義，三七組術后14 d MVD值高于模型組(P<0.05)；三七組術后14 d的MVD值顯著高于術后3 d(P<0.05)。三七組在術后3 d及14 d VEGF的表達高于模型組及假手術組(P<0.05)。結論 三七可以促進大鼠缺血下肢毛細血管密度增加，促進VEGF表達，促進血管新生。

下肢缺血；三七；毛細血管密度；血管內皮生長因子

下肢缺血疾病其主要原因是動脈狹窄或閉塞而引起下肢動脈的供氧量與組織靜息狀態下維持生存能力的氧氣需求量之間不均衡所致，其臨床主要表現為因相應供血區域缺血、缺氧引起的間歇性跛行、靜息痛、潰瘍及壞疽，嚴重者可出現全身中毒癥狀[1]，嚴重影響病人生存時間和生活質量。三七中的主要成分三七總皂苷(PNS)通過調節脂質代謝，抑制血管平滑肌細胞的增殖，抗氧自由基，抗凝血、促纖溶、抑制血小板聚集、改善高凝狀態而起到抗動脈粥樣硬化(AS)的作用[2]。本研究通過對大鼠下肢缺血模型中毛細血管密度(MVD)及血管內皮生長因子(VEGF)表達的觀察，探討三七對大鼠下肢缺血后的新生作用影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 SD大鼠購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(軍)2012-0004，雄性，體重250 g～300 g。SP免疫組化試劑盒及抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體，購自北京博奧森公司。

1.2 大鼠下肢缺血模型的制備及分組 10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)行大鼠腹腔注射麻醉，選左側腹股溝中點向膝部作一長度約1.5 cm的縱行切口，緊貼腹股溝下方分離股動脈主干，行股動脈結扎及分支剔除術，造成下肢血管缺血模型。造模后隨機分為兩組，模型組予以生理鹽水，三七組給予三七。

1.3 中藥制備及給藥方法 三七組將中藥三七用普通粉碎機初粉后再用超微粉碎機制成極細粉，溫開水調，攪拌勻，灌胃備用，給藥劑量為0.571 g/(kg·d)。模型組和假手術組灌服蒸餾水1 mL/100 g，每日1次，連續14 d。

1.4 檢測指標 術后3 d、14 d，各組取大鼠20只，用免疫組化法觀測缺血下肢毛細血管密度及VEGF的表達。

1.4.1 缺血組織中毛細血管密度的測定 取大小為0．5 cm的缺血下肢內收肌肌肉2塊～3塊，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，用4%的多聚甲醛固定，將4 μm的組織經石蠟包埋后連續切片，切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃過夜，再經脫蠟，抗原修復，PBS洗3次，5 min，再按照美國ZYMED公司SP系列試劑盒即過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒說明書進行標本染色，然后進行400倍的顯微照相。

1.4.2 缺血組織中VEGF的表達 將組織切片以抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體進行免疫組化染色，棕黃色顆粒為VEGF陽性，采用圖像分析系統測定缺血區400倍視野下的光密度值，每張切片觀察7個視野，取均數作為VEGF蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情況 分離、結扎和切斷下肢血管的效果明顯。3組大鼠無死亡，三七組和模型組的大鼠均有不同程度的活動障礙，3 d后傷口漸愈合，14 d后痂脫落，未見壞死。

2.2 3組術后3 d及14 d的MVD值比較 三七組在術后3 d及14 d的MVD值高于假手術組(P<0.05)；與模型組比較，三七組術后3 d MVD值差異無統計學意義，三七組術后14 d MVD值高于模型組(P<0.05)；與假手術組比較，模型組術后14 d MVD值高于假手術組(P<0.05)，三七組術后14 d的MVD值顯著高于術后3 d(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組術后3 d及14 d的MVD值比較(±s)

2.3 3組術后3 d及14 d VEGF的表達比較 三七組在術后3 d及14 d VEGF的表達高于模型組及假手術組，三七組與模型組比較，缺血組織中VEGF有增高趨勢，提示三七可上調下肢缺血后VEGF的表達(P<0.05)；三七組與假手術組比較，VEGF增高(P<0.05)；模型組與假手術組比較，模型組VEGF有增高趨勢，表明缺血后的組織VEGF會應激性增高(P<0.05)；三七組術后3 d和14 d兩個時間點相比，VEGF表達差異無統計學意義。詳見表2。

表2 3組不同時間點VEGF表達(±s)

3 討 論

3.1 VEGF、MVD與血管新生的關系 VEGF是一種肝素結合的二聚體多肽糖蛋白，能特異地作用于血管內皮細胞，促使血管內皮細胞分裂增殖、增生和轉移，從而形成新的血管并增加血管通透性；是目前治療性血管新生中研究最廣泛的因子之一，它有兩類高親和力酪氨酸激酶受體：VEGF受體1(fms-like tyrosine kinase，flt-1 )和VEGF受體2(kinase insert domain-containing receptor，KDR )，VEGF 受體可與VEGF 特異性結合，發揮促血管新生作用；VEGF也是目前發現的最重要血管生長因子之一，它可以特異性地促進血管內皮細胞進行有絲分裂，具有誘導新生血管生成的作用[3-4]，在缺血疾病發生發展過程中，機體具有一定的代償機制，主要表現為血管新生和側支循環建立[5]，VEGF對其形成過程有著重要作用。MVD值是評價血管生成的指標，MVD值越高說明新生毛細血管越豐富。本實驗結果顯示，術后3 d及14 d三七組VEGF的表達高于模型組及假手術組，三七組與模型組比較，缺血組織中VEGF有增高趨勢(P<0.05)；術后14 d三七組MVD值高于模型組(P<0.05)。

3.2 三七與下肢缺血的關系 中醫認為下肢缺血性疾病多因“寒濕、氣滯、血瘀、痰濁”等閉阻經絡、氣血不通、陽氣不達而致，其最終病機均為氣血凝滯，經絡阻塞。因此多數醫家治療本病以活血化瘀法貫穿始終[6]。三七化瘀不傷正，止血不留瘀，效在化瘀止血，活血定痛，故與缺血性疾病有著密切關系。現代研究證明三七能抑制血小板聚集和血漿凝固因子，保護缺血性心肌細胞損傷、抑制血栓形成，降低血脂、血糖、抗炎及抗衰老等方面都有作用[7]。另有研究表明三七總皂苷可顯著提高心肌梗死大鼠心肌細胞VEGF、bFGF蛋白表達，促進缺血心肌的血管新生，從而達到保護心肌缺血性損傷的作用[8]。本實驗結果顯示，三七有促進下肢缺血性病變新生血管形成的作用，其機制可能是VEGF表達增加，從而促進血管生成，但是該藥除能增加VEGF的表達，是否也能增加CD34+陽性細胞的比例，通過多條信號通路誘導新生血管產生保護內皮功能，還待進一步研究。

[1] Latza U，Stang A，Bergnmnn M，et al．The problem of response in epidemiological studies in Germany[J]．Gesundheitswesen，2004，66(5)：326-336．

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[3] 陳萌，婁利霞，吳愛明，等.活血益氣方及其拆方藥物血清對VEGF165轉染臍靜脈內皮細胞分泌MMP-9，MMP-2的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(2)：156．

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(本文編輯郭懷印)

山西省衛生廳科研課題(No.201201096)

1.山西省中醫藥研究院(太原 030012)；2.山西中醫學院附屬醫院

李廷荃，E-mail:shanxiwangyanbin@163.com

R543.5 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．011

1672-1349(2016)04-0371-02

2015-10-18)