依維莫司對胃癌細胞株生長、遷移和侵襲的作用研究

俞榕，沈迎春

依維莫司對胃癌細胞株生長、遷移和侵襲的作用研究

俞榕，沈迎春

目的探討依維莫司對胃癌細胞HGC-27和KATO III生長、遷移和侵襲的作用。方法采用MTT試驗檢測兩種胃癌細胞在不同濃度依維莫司作用下的生長狀況，并計算出相應的IC50值；采用流式細胞儀技術檢測依維莫司作用后細胞周期狀況；采用Annexin V/PI雙染法檢測依維莫司作用后細胞凋亡狀況；采用Transwell法檢測依維莫司作用后細胞的遷移和侵襲能力變化；采用Western blot法檢測兩種細胞的mTOR蛋白表達水平。結果依維莫司顯著抑制HGC-27細胞和KATO III細胞的生長，并且這種抑制作用具有濃度依賴性；依維莫司誘導HGC-27細胞和KATO III細胞發生G1期阻滯；依維莫司誘導KATO III細胞發生凋亡，但不誘導HGC-27細胞發生凋亡；依維莫司抑制HGC-27細胞和KATO III細胞的遷移和侵襲能力；mTOR蛋白在HGC-27和KATO III細胞中均有表達。結論依維莫司可以顯著抑制胃癌細胞的生長、遷移和侵襲，可以作為臨床上治療胃癌，預防胃癌復發的靶向藥物。

胃腫瘤；癌；依維莫司

目前我國每年約40余萬成為胃癌新患者，而約30余萬胃癌患者死亡［1］。雖然外科手術已成為胃癌最主要的治療手段，但部分患者仍需行化療以延長生存期，降低復發率。目前靶向治療藥物在腫瘤治療中吸引著眾人的眼球。本研究檢測目前臨床上常見的靶向藥物mTOR抑制劑依維莫司對胃癌細胞株HGC-27［2］和KATO III細胞［3］生長、遷移和侵襲的作用。現將結果報道如下。

1　資料與方法

1.1材料人胃癌細胞株 HGC-27和KATOIII均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；依維莫司購自瑞士novartis公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；青鏈霉素購自美國Sigma公司；MTT試劑購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC雙染色試劑盒購自美國Invitrogen公司；Transwell細胞培養小室購自美國corning公司；抗mTOR單克隆抗體購自美國santacruz生物公司；蛋白提取試劑盒購自美國BD公司；羊抗鼠二抗購買自美國KPL公司；ECL化學發光試劑盒購買自美國Pierce公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養將人胃癌細胞株HGC-27和KATOIII培養在10 cm培養皿中，細胞均采用RPMI 1640培養基進行培養，RPMI 1640培養基中需添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素。細胞培養在37℃，含5%CO2、95%空氣的恒溫培育箱中。細胞培養基每天更換，當細胞生長至70%～80%匯合程度時即予以0.25%的胰蛋白酶消化，然后以1∶3的比例接種至3個新的培養皿中。

1.2.2MTT試驗將處于對數生長期的兩種胃癌細胞接種消化接種至96孔板，保持每孔細胞數目約5×103個。在細胞培育過夜后，分別加入不同濃度的依維莫司（0、1、2、4、8、16、32 mol/L）。在藥物處理72 h后，去除含有藥物的培養基，PBS沖洗細胞，加入MTT溶液；在細胞與MTT溶液共同孵育4 h后，去除MTT溶液，加入DMSO溶液。然后振蕩混勻，在37℃孵育10 min。上酶標儀檢測490 nm處的吸光值。根據MTT結果測算出IC50值，在后續實驗中依維莫司采用IC50值的濃度進行。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期采用流式細胞儀檢測細胞周期，選取對數生長期的HGC-27和KATO III細胞接種于6孔板培育過夜。分別加入0、10、20、30、40 mmol/ml依維莫司，在藥物作用72 h后收集細胞，預冷的70%乙醇在4℃下固定細胞過夜，然后分別加入PI（終濃度50 g/ml）和冰冷RNA酶（終濃度50 g/ml）染色0.5 h，樣本上流式細胞儀進行檢測，采用 Flowjo軟件對流式細胞儀數據進行分析。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，所有操作按照說明書進行。選取對數生長期的HGC-27和KATO III細胞接種于6孔板培育過夜。分別加入0、10、20、30、40 mmol/ml依維莫司，在藥物作用72 h后收集細胞，PBS沖洗細胞后，分別在避光條件下加入Annexin VFITC試劑和PI試劑進行雙染色0.5 h。然后在1 h內上流式細胞儀進行檢測。

1.2.5細胞遷移和侵襲試驗采用Transwell小室試驗檢測細胞遷移和侵襲情況。選取藥物處理48 h和藥物未處理的HGC-27和KATO III細胞接種于Transwell小室的上室（遷移試驗）或鋪有基質膠的上室（侵襲試驗），然后采用無血清培養基進行培養，在Transwell小室的下室加入含15%胎牛血清的培養基。在培養72 h后，去除小室中培養基，PBS沖洗后甲醇固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞和基質膠。然后在光鏡下技術染色的細胞數目。

1.2.6western blot檢測mTOR的表達水平首先采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，然后采用BCA法進行蛋白定量。取30g蛋白進行變性后，上樣到10%的SDS-PAGE膠，進行電泳1 h；然后采用麗春紅進行膠染色，在確定有蛋白條帶后用PVDF膜轉膜1 h；將附有蛋白的膜采用脫脂奶粉封閉，然后分別加入相應的抗 mTOR單克隆一抗（1∶1 000），在4℃下孵育過夜，然后加入二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h，然后采用 ECL發光試劑盒在暗室中進行熒光發光，并用膠片進行顯影和定影。本實驗采用 -actin蛋白作為內參照。

1.2.7統計方法所有數據采用 SPSS 11.0進行統計分析，計量資料采用均數±標準差的形式表示；多組比較采用單因素方差分析分析，兩組比較采用 檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1依維莫司抑制 HGC-27細胞和KATOIII細胞的生長通過MTT試驗，發現依維莫司處理72 h對兩種胃癌細胞HGC-27和KATO III都有顯著的生長抑制作用，并且這種生長抑制作用具有濃度依賴性。藥物濃度越高，生長抑制作用越顯著（封二彩圖4）。依維莫司對HGC-27和KATO III細胞的IC50值分別為1.606 mol/L和5.944 mol/L。在后續實驗中，本研究采用的依維莫司濃度分別為兩種細胞所計算出的IC50值。

2.2依維莫司誘導 HGC-27細胞和KATOIII細胞發生G1期阻滯通過流式細胞儀檢測細胞周期，筆者發現在依維莫司作用72 h后，HGC-27和KATO III細胞出現了G1期阻滯，表現為G1期細胞比例增高（=7.521、9.195，均＜0.05），S和G2期細胞相對減少。其中藥物處理組HGC-27細胞G1期比例為（72.71±1.83）%，對照組 G1期比例為（61.67±1.76）%；藥物處理組KATOIII細胞G1期比例為（73.51±1.69）%，對照組G1期比例為（60.64±1.74）%。

2.3依維莫司誘導KATO III細胞發生凋亡通過流式細胞儀檢測細胞凋亡，發現依維莫司作用72 h后，KATOIII細胞發生顯著的凋亡（=10.601，＜0.05），藥物處理組KATOIII細胞凋亡比例為（28.30±1.99）%，對照組凋亡比例為（9.79±2.27）%；另外，依維莫司并不誘導HGC-27細胞發生凋亡，藥物處理組細胞凋亡比例（［9.32±1.24）%］和對照組細胞凋亡比例（［8.96%±0.90%）］差異無統計學意義（=1.006，＜0.05）。

2.4依維莫司抑制 HGC-27細胞和KATOIII細胞的遷移和侵襲能力通過Transwell遷移和侵襲試驗，發現依維莫司作用72 h后，HGC-27細胞和KATO III細胞的遷移能力和侵襲能力顯著降低，表現為兩種細胞穿過Transwell膜的數目顯著少于對照組。遷移試驗中藥物處理組穿膜的 HGC-27細胞數量為（123.7±28.4）個，對照組為（238±43.9）個，差異有統計學意義（=3.785，＜0.05）；藥物處理組穿膜的KATOIII細胞數量為（139.7±27.6）個，對照組為（231.3±48.2）個，差異有統計學意義（=2.858，＜0.05）。侵襲試驗中藥物處理組穿膜的HGC-27細胞數量為（67±4.6）個，對照組為（198±9.6）個，差異有統計學意義（=21.251，＜0.05）；藥物處理組穿膜的KATOIII細胞數量為（63.3±1.5）個，對照組為（151.3±29.3）個，差異有統計學意義（=5.202，＜0.05）。

2.5mTOR蛋白在HGC-27和KATO III細胞中的表達水平通過 western blot實驗，筆者檢測了 mTOR蛋白在HGC-27細胞和KATOIII細胞中的表達水平。結果顯示，mTOR蛋白在兩種胃癌細胞中均有表達。見封二彩圖5。

3　討論

依維莫司是雷帕霉素的衍生物，也是mTOR蛋白抑制劑，多項研究表明其具有抗腫瘤的作用，2012年新英格蘭醫學雜志就曾報道過依維莫司應用于雌激素陽性的絕經婦女乳腺癌患者的三期臨床試驗，取得了較好的療效［4］。另有研究發現依維莫司可作為轉移性腎癌患者在應用血管內皮生長因子受體（VEGFR）酪氨酸激素抑制劑如貝伐單抗等治療失敗后的替代藥物，并可收到較好的療效［5］。但目前關于依維莫司在胃癌治療中的作用尚存在爭議，一些研究認為依維莫司可以顯著延長一部分胃癌患者生存期［6］，而一些研究認為依維莫司無法顯著延長胃癌患者生存期［7］。

本研究通過基礎實驗探討依維莫司對胃癌細胞株HGC-27和KATO III的作用。依維莫司是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的特異性抑制劑，可以顯著抑制 mTOR的活性及其介導的下游通路。通過western blot試驗，筆者發現mTOR在兩種細胞中均正常表達，表達水平差異無統計學意義。通過MTT試驗，筆者發現依維莫司在體外可以顯著抑制HGC-27和KATOIII細胞的增殖，并且這種抑制作用具有濃度依賴性。HGC-27屬于未分化胃癌細胞，KATOIII屬于低分化胃癌細胞。未分化癌細胞通常對于化療藥物更敏感，在研究中筆者發現依維莫司對HGC-27細胞的半數致死濃度（IC50）值更低。

目前已知依維莫司可能通過以下三種途徑抑制細胞生長：誘導周期阻滯［8］、誘導細胞凋亡［9］和促進細胞自噬［10］。筆者通過細胞周期檢測發現，依維莫司可以誘導兩種胃癌細胞均發生G1期阻滯。這與他人結果相符合，說明依維莫司可以通過調控細胞周期進程而抑制細胞生長。依維莫司誘導細胞周期阻滯的機制主要依賴于其作為mTOR抑制劑，可以與mTOR結合，抑制mTOR的活性，然后激活ERK/MAPK信號轉導通路，下調周期相關蛋白cyclinD1表達，上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）如p21、p27等蛋白的表達，誘導周期進程阻滯，導致生長阻滯［11］。目前研究發現，依維莫司除了可以誘導周期阻滯外，還可以誘導細胞凋亡。本研究發現，依維莫司可以誘導KATOIII細胞凋亡，卻不能誘導HGC-27細胞凋亡，說明依維莫司可能通過調控細胞周期而發揮抑制HGC-27細胞生長的作用，而依維莫司對于KATOIII細胞生長的調控可能涉及周期阻滯和細胞凋亡兩個方面。

除此之外，筆者還發現依維莫司顯著抑制HGC-27和KATOIII細胞的遷移和侵襲，這與前人在其他腫瘤中的研究結果相仿［12］，說明依維莫司可以調控腫瘤細胞的遷移和侵襲特性，但其中的具體分子機制卻未見報道，有待以后實驗的闡明。

總之，依維莫司可以作為治療胃癌的潛在藥物，但其具體療效和副作用仍有待大規模臨床試驗驗證。

［1］鄒小農，孫喜斌，陳萬青，等.2003-2007年中國胃癌發病與死亡情況分析［J］.腫瘤，2012，32（2）:109-114.

［2］Akagi T，Kimoto T.Human cell line （HGC-27）derived from the metastaticlymph node of gastric cancer［J］.Acta Med Okayama，1976，30（3）:215-219.

［3］Sekiguchi M，Sakakibara K，Fujii G.Establishment of cultured cell lines derived from a human gastric carcinoma［J］.Jpn J Exp Med，1978，48（1）:61-68.

［4］Baselga J，Campone M，Piccart M，et al. Everolimus in postmenopausal hormonereceptor-positiveadvancedbreastcancer［J］. N Engl J Med，2012，366（6）:520-529.

［5］Park K，Lee JL，Ahn JH，et al.Efficacy and safety of everolimus in Korean patients with metastatic renal cell carcinoma following treatment failure with a vascular endothelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor［J］.CancerResTreat，2014，46（4）:339.

［6］Yoon DH，Ryu MH，Park YS，et al.Phase II study of everolimus with biomarker explorationinpatients withadvancedgastric cancer refractory to chemotherapy including fluoropyrimidine and platinum［J］.Br J Cancer，2012，106（6）:1039-1044.

［7］Ohtsu A，Ajani JA，Bai YX，et al.Everolimus for previously treated advanced gastric cancer:results of the randomized，double-blind，phase III GRANITE-1 study［J］.JClinOncol，2013，31（31）:3935-3943.

［8］Ji D，ZhangZ，Cheng L，et al.Thecombination of RAD001 and MK-2206 exerts synergistic cytotoxic effects against PTEN mutant gastric cancer cells:involvement of MAPK-dependent autophagic，but not apoptotic cell death pathway［J］.PLoS One，2014，9（1）:e85116.

［9］Liu N，Tai S，Ding B，et al.Arsenic trioxide synergizes with everolimus（Rad001）to induce cytotoxicity of ovarian cancer cells through increased autophagy and apoptosis［J］.Endocr Relat Cancer，2012，19 （5）:711-723.

［10］Baraz R，Cisterne A，Saunders PO，et al. mTOR Inhibition by Everolimus in Child hood Acute Lymphoblastic Leukemia Induces Caspase-Independent Cell Death［J］. PLoS One，2014，9（7）:e102494.

［11］XiangXD，YuJ，Li GF，et al.Invitrostudy on blocking mTOR signaling pathway in EGFR-TKI resistance NSCLC［J］.Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）:394-397.

［12］Wedel S，HudakL，Seibel JM，etal.Impact of combinedHDAC and mTOR inhibition on adhesion，migration and invasion of prostate cancer cells［J］.Clin Exp Metastasis，2011，28（5）:479-491.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.033

R735.2

A

1671-0800（2016）04-0478-03

2015-02-08

（本文編輯：姜曉慶）

330200寧波，鄞州區集市港鎮衛生服務中心（俞榕）；寧波市醫療中心李惠利醫院（沈迎春）

俞榕Email：huangjie1981_ 1981@163.com