基因敲除技術在維生素D受體研究中的應用進展

肖碩　文九芳

·綜述·

基因敲除技術在維生素D受體研究中的應用進展

肖碩文九芳

434020 荊州，華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院藥劑科(肖碩)；434000 荊州，荊州市第一人民醫院藥劑科(文九芳)

【摘要】基因敲除技術是一種新的生物遺傳工程技術，在生物和醫學領域的應用日趨廣泛。維生素D通過維生素D受體的介導發揮多種生理作用，借助維生素D受體的基因敲除技術可更清楚地研究維生素D的多種生理功能，為以后的生物研究提供新的方向與方法。該文就基因敲除技術應用于維生素D受體后對機體腸道功能、抗腫瘤功能、心血管功能方面影響的研究進展作一綜述。

【關鍵詞】基因敲除技術；維生素D；維生素D受體

基因敲除技術是一種新型分子生物學遺傳技術，它針對某個功能未知或者未明確的基因序列來改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失，屏蔽這部分功能，并進一步研究其對生物體造成的影響，從而推測出該基因的生物學功能[1]。維生素D與維生素D受體(VDR)是近年來兒科、心血管科、消化科研究的熱門因子，維生素D在機體骨代謝之外的多種生物學功能已日益引起人們的重視，其功能的實現離不開VDR的介導。VDR是一種細胞內類固醇/甲狀腺激素受體，維生素D的多種生理功能均通過其活性成分1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2-D3]與VDR結合介導調節生物體內的靶基因轉錄而實現。因此，深入研究VDR對明確維生素D的各種生理功能及其在生物醫學上的作用有重要價值。傳統的VDR研究基點在于VDR基因存在單個堿基突變，即單核苷酸多態性(SNP)，通過多聚酶鏈-限制性內切酶特異性酶切進行功能識別，研究其基因多態性。近年來，基因敲除技術發展逐漸成熟，對生物體內的VDR進行基因敲除有助于更清楚地研究其功能，對臨床有重要意義。

一、基因敲除技術的原理與特點

基因敲除和基因嵌入技術是上世紀80年代末出現的最新外源DNA導入技術[2]。基因敲除技術類似于基因的同源重組，將外源DNA與受體細胞基因中序列相同或類似的基因發生同源重組，代替受體細胞基因組中該序列，整合入受體細胞的基因組中，屬于外源基因在體內的定點整合,是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術[3]。除了同源重組外，基因的插入突變和RNA干擾(RNAi)技術同樣可以達到基因屏蔽的目的。基因敲除技術克服了基因隨機整合的盲目性與隨機性，是一種理想的改造生物遺傳物質的方法，為我們提供了全新的研究手段。目前，基因敲除技術在生物醫學上的應用主要在于動物模型的建立，其中小白鼠的模型研究較為成熟，大型哺乳動物的基因敲除模型尚處于探索階段[4]。

二、維生素D與VDR簡介

維生素D為一類固醇激素，通過作用于細胞核內的特異性受體，與受體形成激素-受體復合物，激活或抑制含有維生素D反應元件的基因，影響DNA的轉錄，發揮多種生物學作用。人體缺乏維生素D不僅可表現為佝僂病和骨軟化癥，還可能引發癌癥、心血管疾病、內分泌疾病、自身免疫性疾病、神經系統疾病及結核[5]。而研究維生素D 的功能，離不開對VDR的研究。VDR為親核蛋白，能在多個器官與組織中表達，是介導維生素D的活性成分1,25-(OH)2-D3發揮生物效應的核內生物大分子超家族成員，維生素D的多種生理功能均通過VDR來實現[6]。1,25-(OH)2-D3激素信號分子在靶細胞上與VDR結合形成激素-受體復合物，作用于靶基因上的特定DNA序列，調控結構基因的表達[7]。VDR基因是1,25-(OH)-D3發揮生理效應的候選基因之一，采用新型的基因敲除技術研究VDR的基因表達，檢測機體內該受體的表達對各種生理功能的影響，可以開辟新的研究維生素D及VDR的方向[8]。

三、基因敲除VDR后機體功能研究

1. 基因敲除VDR后機體的腸道功能

Cordin等[9]基因敲除小白鼠的VDR，以同窩繁殖未接受基因敲除的小鼠作為對照組，對2組小鼠腸道上皮細胞的裂解物用Ab099進行蛋白免疫印跡分析，發現對照組的VDR分析帶明顯，而基因敲除組的分析帶幾乎不可見，用共聚焦顯微鏡觀察也發現基因敲除組腸道細胞表面無1,25-(OH)2-D3。他們進一步對從2組分離出的腸道細胞進行類固醇激素刺激的鈣攝取試驗，發現基因敲除組腸道細胞反應鈍化或完全無反應，而對照組腸道細胞于5 min內鈣攝取增強。因此他們得出結論，VDR的存在介導1,25-(OH)2-D3發揮生物活性，明顯增強機體對鈣的吸收能力。康紅等[10]制備VDR和CaBP-D28k雙基因敲除小鼠，他們用普通食物和高鈣食物喂養野生型與雙基因敲除后的小鼠，檢測兩者體內瞬時感受器電位V5(TRPV5)蛋白和 TRPV6蛋白的mRNA水平。結果顯示，普通飲食下，雙基因敲除小鼠尿鈣的分泌和血清甲狀旁腺激素水平高于野生型小鼠，但兩者TRPV5和 TRPV6的表達無明顯差異；高鈣飲食下，基因敲除小鼠的血鈣水平正常，但TRPV5和 TRPV6的表達降低。研究表明，上皮鈣通道基因受鈣和維生素D的調節,CaBP-D28k的缺失對兩者無影響。腎鈣的重吸收減少與TRPV5和TRPV6基因表達無關。

2. 基因敲除VDR后機體的抗腫瘤功能

Keith等[11]進行了系列實驗，包括提取基因敲除VDR小鼠的細胞誘導穩定表達野生型或基因突變型VDR，以便研究VDR結合1,25-(OH)2-D3的功能、VDR配體的功能及VDR對生物功能的調控作用。PDGFB, VEGFA和NFKBI均為基因研究的靶點[12]。基因敲除VDR的細胞產生的點突變(W286R, R274L)導致小鼠對生理劑量下的1,25-(OH)2-D3耐受不明顯，而對大劑量的1,25-(OH)2-D3反應明顯，蛋白免疫印跡分析顯示VDR產生的表達帶明顯減弱。基因敲除VDR的細胞的G46D點突變直接消除VDR上與1,25-(OH)2-D3的連接配基，從而產生生長抑制。因此，即使生物體在VDR蛋白、輔酶因子、靶點基因等方面存在差異與變化，人類和小鼠引起抗癌反應的VDR信號軸均是高度保守的[13]。有學者發現，基因敲除VDR的雌性小鼠更容易患生殖系統腫瘤[13]。有研究顯示，基因敲除VDR后3種乳腺癌標志物——雌激素受體、孕激素受體和原癌基因人類表皮生長因子受體2(HER2)會出現減少或缺失，提示VDR在介導機體吸收維生素D和減少女性乳腺癌風險方面有重要作用[14]。

3.基因敲除VDR后機體的心血管功能

有研究顯示，野生型小鼠和基因敲除VDR小鼠主動脈中內皮型一氧化氮合酶、內皮素-1基因表達產物均有表達，但與野生型小鼠比較，前者在基因敲除VDR的小鼠中的表達明顯少,后者的表達則明顯高，且基因敲除VDR小鼠的收縮壓、舒張壓明顯高于野生型小鼠(P均<0.05)[16-17]。Bae等[18]對野生型和基因敲除VDR小鼠分別進行了假性心肌梗死手術，術后4周觀察兩者的手術情況，結果顯示，基因敲除VDR小鼠的生存率和心臟功能等情況較野生型小鼠差，且細胞凋亡、炎癥和纖維化更嚴重，因此他們得出結論，VDR對心肌梗死后細胞有間接保護作用。

四、小結與展望

作為一種新型的生物技術，基因敲除技術有助于建立生物模型、研究疾病的分子機制及進行基因治療。在傳統意義上，維生素D的主要功能為調節鈣磷代謝與骨代謝平衡，但近年來，我們發現其尚有其它多種的生物功能，例如介導抗炎反應、抗腫瘤反應、免疫調節、心血管調控等。如上文所述，對生物體內的VDR進行基因敲除有助于更清楚地研究維生素D的生理功能。但基因敲除技術仍存在某些不足，一方面，基因敲除技術不易準確使用，基因重組的隨機性依然很大，會對實驗結果的準確性造成影響；另一方面，維生素D作用范圍廣，較多相關的機制尚未明確，仍有待進行更大量的臨床研究，因此，基因敲除技術在VDR研究中的應用仍需深入。

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Application progress in gene knock-out of vitamin D receptor

XiaoShuo,WenJiufang.

DepartmentofPharmacy,JingzhouHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology，Jingzhou434020，China

【Abstract】Gene knock-out, as a novel type of genetic engineering technology, has been more and more widely applied in the field of biomedicine. Vitamin D plays a variety of physiological roles through the mediation by vitamin D receptor. Application of gene knock-out of vitamin D receptor can explicitly investigate multiple physiological functions of vitamin D, providing orientation and method for the biological research in the future. In this paper, the effects of gene knock-out of vitamin D receptor upon intestinal function, anti-tumor function and cardiovascular function were reviewed.

【Key words】Gene knock-out technology; Vitamin D; Vitamin D receptor

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.002

(收稿日期：2016-05-04)(本文編輯：洪悅民)