HPV16 E7蛋白在宮頸癌中的作用研究進展

羅小蘭綜述，毛熙光審校（四川醫科大學第一附屬醫院婦產科，四川瀘州646000）

HPV16 E7蛋白在宮頸癌中的作用研究進展

羅小蘭綜述，毛熙光△審校
（四川醫科大學第一附屬醫院婦產科，四川瀘州646000）

宮頸腫瘤；人乳頭瘤病毒16；基因，視網膜母細胞瘤；疫苗；綜述

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤的常見疾病，嚴重威脅女性的生命健康。我國每年的新發病例占世界總新發病例的30%左右，且宮頸癌患者以每年2%～3%的速度增長。近年來，多數宮頸癌調查結果顯示發病年齡趨于年輕化。現有研究表明，人乳頭瘤病毒（HPV）感染特別是高危型HPV感染是絕大多數宮頸癌癌前病變和宮頸癌的主要原因［1］。而HPV16與HPV18在宮頸癌高危型HPV中最常見。HPV16型感染多見于宮頸鱗狀細胞癌（占宮頸癌的75%～80%），而HPV18多見于宮頸腺癌（占宮頸癌的20%～25%）。E6、E7基因持續表達是宮頸上皮細胞發生惡性轉化及持續進展為宮頸癌浸潤的必要條件［2］。而HPV16的早期基因E7是致癌的關鍵基因之一，E7基因編碼的E7蛋白能與成視網膜母細胞瘤蛋白結合，進一步使宿主細胞繞過R點，由DNA合成前期（G1期）直接進入DNA合成期（S期），抑制宿主細胞的凋亡，導致細胞生長失控，對腫瘤血管的新生有促進作用，與E6蛋白協同使細胞發生永生化等。但值得注意的是，E7蛋白作為腫瘤特異性排斥抗原，含多個線性B細胞表位、CD4+T細胞表位和CD4+細胞毒性T淋巴細胞表位，與主要組織相容性復合體（MHC）分子親和力高、抗原性強，是研制HPV治療性疫苗的首選靶抗原。E7在宮頸癌細胞生長、增殖、遷移及細胞周期調控等方面起著重要作用，與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關。

1　HPV16　 E7　蛋白的主要生物學特性

HPV16 E7蛋白由HPV16病毒的E區基因編碼，共含有98個氨基酸的酸性磷酸蛋白，相對分子質量為16×103～18×103。HPV16 E7蛋白有3個主要的功能區域：Ⅰ區位于第1～15位氨基酸；Ⅱ區位于第16～37位氨基酸，Ⅱ區有1個與腫瘤抑制蛋白RB相結合的位點LXCXE，位于第22～26位氨基酸。LXCXE通過與RB結合，促進其降解，使原本與之結合的真核細胞起始轉錄因子E2F失去調控而釋放，使細胞進入S期，引起細胞周期失調。Ⅱ區還含1個酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）位點，該位點上的第31、32位絲氨酸常被磷酸化，增加了HPV16 E7蛋白與轉錄因子IID（TFIID）的關鍵組件TATA合子結合蛋白的親和性，而TFIID通過與啟動子結合從而調控細胞的轉化過程。Ⅲ區位于第38～98位氨基酸，該區域內含2個鋅指結構和多個CTL的識別位點，可使細胞免疫應答增強［3］。現以CTL表位為基礎，設計以E7蛋白位靶抗原的治療性肽疫苗的研究越來越受到重視［4］。HPV16 E7蛋白鋅指結構域內的LRLCV（第65～69位氨基酸）通過與核孔蛋白62（NUP 62）的FG區作用使E7能順利進入細胞核內［5］。若E7蛋白的鋅指結構發生突變，E7蛋白就失去使細胞轉化的能力。

2　HPV16　 E7　蛋白在宮頸癌發生中的作用及其機制

2.1E7蛋白與pRB相互作用，使宿主細胞失去正常細胞周期調控作用細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程。細胞周期分為G1期、S期、DNA合成后期（G2期）及細胞分裂期（M期）。HPV16 E7蛋白含有2個高度保守的CR1、CR2區域及1個羧基端。羧基端內存在2個鋅指結構。CR2中Leu-X-Cys-X-Glu（LXCXE）結構，能與pRB相互作用，使其發生磷酸化，釋放原本結合在pRB上的另一細胞轉錄因子E2F。E2F可作用于含有E2F結合位點的下游細胞周期調節蛋白的基因，引起一系列調節細胞周期的細胞因子的改變，如細胞周期蛋白、p16、p107、P130及c-Myc等，使宿主細胞繞過R點，由G1期直接進入S期，抑制宿主細胞的凋亡，導致細胞生長失控［6］。另有研究表明，E7蛋白能與叉頭框蛋白M1（FoxM1）結合，并增加E7蛋白的轉化活性及FoxM1的轉錄活性，從而使正常細胞周期失調［7］。

2.2HPV16 E7蛋白能夠促進腫瘤血管新生任何腫瘤的發生都必須有血管的新生過程。腫瘤的新生血管與腫瘤的發生、發展及轉移關系密切，因其能為腫瘤細胞提供足夠的氧氣和養料，且部分腫瘤細胞可通過新生的血管發生遠處轉移。血管生成的過程與低氧誘導因子-1α （HIF-1α）密切相關，且受到微環境中多種細胞因子的影響，如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、基質金屬蛋白酶等。在常氧環境下，HIF-1α脯氨酸發生羥基化，與von Hippel-Lindau蛋白結合，觸發泛素-蛋白酶體蛋白水解，使其半衰期迅速變短［8］。HPV16 E7蛋白可誘導組蛋白去乙酰化酶與HIF-1α分離，使HIF-1α依賴受體活性上調，進而促進腫瘤血管的新生［9］。HP16 E7和RB蛋白結合釋放轉錄因子E2F與HPV E7基因下游的核糖核苷酸還原酶亞基M2基因結合，產生活性氧，激活ERK1/2信號通路，使HIF-1α和VEGF表達上調來促進血管新生，最終導致癌癥的發生［10］。免疫組織化學分析表明，RRM2水平與人類宮頸癌HPV16 E7水平呈正相關。HPV16表達E7只能使促血管生成因子表達顯著增加，但并不足以誘導內皮細胞遷移。

2.3HVP16 E7蛋白與視黃酸受體β基因（RARB基因）的關系RARB基因是新發現的一種抑癌基因，其表達產物能抑制E6、E7基因的轉錄。RARB基因可通過分離轉錄因子AP-1與病毒調控區域，減弱HPV基因的表達。RARB基因甲基化可導致該基因沉默，使RARB表達缺失，對HPV16 E6、E7基因的抑制作用消失，從而E7蛋白的表達增高，促進了癌癥的發生［11］。有研究表明，轉染RARB質粒的Hela細胞可表達視黃酸，從而抑制單克隆細胞的生長［12］。但Gutiérrez等［13］提出HPV16 E7蛋白使被HPV16感染細胞的RARB mRNA 和RARB蛋白表達增高；在表達E7蛋白的細胞中，RARB的過表達進一步導致了腫瘤抑制基因p53R237C突變的發生。RARB基因屬于腫瘤抑癌基因，理論上其在宮頸癌細胞中應不表達或表達下調，但多項研究已證實，RARB蛋白在宮頸鱗狀細胞癌中表達增高，其具體機制目前仍不清楚。RARB作為新的抑癌基因，現仍有許多問題尚不清楚，其與HPV感染的關系，在宮頸鱗狀上皮細胞癌中過表達的原因尚需進一步探索。

2.5E7蛋白與感染HPV16細胞的免疫反應及治療性疫苗HPV16 E7蛋白可與E6蛋白協同改變細胞微環境，形成有利于癌細胞發生的微環境，逃避宿主的固有免疫應答，使宿主細胞的功能發生改變，導致宿主細胞的永生化。E6、E7蛋白還可作用于細胞內相關蛋白，引起宿主細胞發生轉化，還可以通過影響宿主的免疫功能逃避宿主對轉化細胞的免疫監視作用，造成HPV16的持續感染。持續性的高危型HPV感染是宮頸癌的重要原因。E6、E7蛋白使促炎性細胞因子，如白介素-18（IL-18）、IL-8和單核細胞趨化蛋白-1和巨噬細胞炎性蛋白-3α等趨化因子表達下降，并能使抗炎分子IL-18結合蛋白高表達［14］，進而抑制免疫反應。E6、E7蛋白能通過操縱細胞內信號通路來抑制抗病毒轉錄因子的活化，包括核因子-κB（NF-κB）和干擾素等［15］。有研究表明，E7蛋白能通過改變核易位和p65乙酰化作用來阻斷NF-κB的活化，進而降低咪喹莫特對HPV16病毒感染的治療效果［16］。

隨著科技的進步宮頸癌的治療方法（手術、放療、化療技術）在不斷提高，但每年仍然有成千上萬的人死于宮頸癌［17］。現已有默克公司針對HPV6/16/18的四價疫苗和葛蘭素史克公司針對HPV16/18的二價疫苗通過美國食品藥物監督管理局審批，予以上市投入使用［18］。但這些預防性疫苗開始使用的時間建議在無性生活前（12歲前），接種對象是未被HPV感染的健康人群，且對已感染相關HPV的女性無治療效果［19］。因此，迫切需要研發針對已感染HPV人群的治療性疫苗。宮頸癌HPV治療性疫苗是指通過機體的免疫作用消除或減少體內已被HPV感染的細胞，從而減少宮頸上皮內瘤變或宮頸癌的發生。E7腫瘤蛋白是一種外源性蛋白，僅在HPV感染的細胞中高表達［20］，且是宮頸癌發生過程中必不可少的關鍵結構。這些特性使得E7蛋白成為最適合的治療性HPV疫苗的特異性靶抗原［21］。目前治療性HPV疫苗的研制雖已經取得一定成果。Trimble等［22］已證實，針對HPV16 E6、E7蛋白的DNA疫苗VGX-3100疫苗對HPV16和HPV18感染所致的中、重度宮頸上皮內瘤變治療效果顯著，為宮頸上皮內瘤變患者提供了除手術治療外的治療方案。治療性疫苗的形式多樣化，除vgx-3100 類DNA疫苗外，還有肽類疫苗、蛋白疫苗、載體疫苗及細胞疫苗等。但治療性疫苗仍有許多問題需要改善，比如怎樣提高疫苗的安全性和提高疫苗的免疫原性等。

不同HPV亞型間的E7蛋白具有同源性。當E7與RAS蛋白結合時，能使其保持低表達水平，減弱其誘導細胞衰老的過程，從而導致細胞過度增殖；有研究發現，當E7蛋白在HPV16感染細胞中持續表達時，可使永生化細胞的端粒酶活性的穩定性進一步增高［23］。PT-3可通過抑制感染HPV的CaSki細胞表達E6、E7來誘導細胞凋亡的發生。PT-3能使CaSki和Hela的生長動力減緩，然而這一作用對HPV陰性的C33A細胞無效［24］。而E2蛋白針對E7蛋白與其他細胞內蛋白的關系仍在探索中。

當敲除CaSki細胞的HPV16 E6和E7基因后，宮頸癌CaSki細胞增殖受到抑制，能促進宮頸癌CaSki細胞凋亡，并降低宮頸癌CaSki細胞遷移和侵襲的能力［25］。

綜上所述，E7蛋白作為HPV16 E7基因編碼的關鍵腫瘤蛋白，在宮頸癌細胞生長、增殖、遷移及細胞周期調控等方面起著重要作用，與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關。因為HPV16 E7蛋白作為腫瘤特異性排斥抗原，含多個線性B細胞表位、CD4+T細胞表位和CD4+CTL表位，與MHC分子親和力高，具有很好的抗原性；僅在HPV16感染的細胞中表達，屬于外源性蛋白；E7蛋白可在宿主細胞表面持續性表達，因為E7的持續性表達使其抗原性得以持續存在，這些因素都使得E7蛋白成為研制HPV治療性疫苗的首選靶抗原。雖然HPV治療性疫苗的研發和使用仍會面臨許多挑戰，但隨著科技的發展，針對E7的治療性HPV疫苗的進一步研發，對控制HPV感染所致子宮頸癌的發病率有著跨時代的作用。

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（2015-10-23）