實(shí)時(shí)熒光定量PCR在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用和質(zhì)量控制

◎莫怡沖

（汕尾市疾病預(yù)防控制中心，廣東 汕尾 516600）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用和質(zhì)量控制

◎莫怡沖

（汕尾市疾病預(yù)防控制中心，廣東 汕尾 516600）

通過概述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、特點(diǎn)，以及其在食品微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品等領(lǐng)域的應(yīng)用和質(zhì)量控制情況，旨在為食品安全監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)；定量檢測(cè)；食品微生物；質(zhì)量控制

隨著人民生活水平的提高，對(duì)食品安全要求越來越高，新版《食品安全法》以“四個(gè)最嚴(yán)”標(biāo)準(zhǔn)，保障人民群眾舌尖上的安全。目前，廣泛應(yīng)用物理、化學(xué)、儀器等檢測(cè)食品方法，由于存在某些局限，無法高效、快速、準(zhǔn)確地滿足現(xiàn)代食品安全檢測(cè)需要，特別是在微生物領(lǐng)域，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無法勝任快速精準(zhǔn)的檢測(cè)要求。

1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)和質(zhì)量控制中的應(yīng)用

1.1食品中致病菌的檢測(cè)

1.1.1坂歧腸桿菌

坂歧腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是運(yùn)動(dòng)型的無孢子、兼性厭氧革蘭陰性桿菌，最近幾年嬰幼兒配方奶粉中坂歧腸桿菌的檢測(cè)已成為世界矚目的焦點(diǎn)。

1.1.2沙門菌

沙門菌（Salmonella）為革蘭陰性無芽孢桿菌，由其引起的食物中毒占世界食物中毒病例之首，是食品安全與質(zhì)量檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

1.1.3副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）是一種嗜鹽性細(xì)菌。主要來源于海產(chǎn)品，如墨魚、海蝦、海蜇等，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。

1.1.4金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引發(fā)多種類型感染和食物中毒的病原菌。RTQ-PCR技術(shù)為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素提供了可靠的方法。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)中的質(zhì)量控制

1.2.1質(zhì)量指標(biāo)

（1）特異性。使用的試劑必須符合國家藥監(jiān)局所批的試劑，序列的特異性必須通過專家所認(rèn)證的。

（2）敏感性。實(shí)驗(yàn)中加入模板的量是微量的，有的是3 μ L，有的是5 μ L，常規(guī)的PCR反應(yīng)體系一般是30～50 μ L（以25 μ L為主）。在30～50 μ L的反應(yīng)體系下，一般模板的量在5 μ L就足夠了。如果從5 μ L變成了10 μ L，雖然可以提高1倍的敏感性，但是里面的干擾物質(zhì)會(huì)相應(yīng)增加，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（3）重復(fù)性。影響重復(fù)性的因素有很多。①儀器間的差異。要及時(shí)對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)、保養(yǎng)。②輔助儀器如離心機(jī)、移液器等，對(duì)于微量的實(shí)驗(yàn)比較重要。③實(shí)驗(yàn)室環(huán)境包括空間環(huán)境和結(jié)構(gòu)環(huán)境。為了防止污染，盡可能做一個(gè)物理的分割，也就是核酸的提取、擴(kuò)增和試劑配制要通過物理分割的方式分開。

1.2.2質(zhì)量環(huán)節(jié)

（1）核酸提取方法（核酸丟失）的影響。目前，核酸提取的方法有很多，傳統(tǒng)的核酸抽提方法主要包括異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、堿抽提法、溴化十六烷基三甲銨（CTAB）抽提法、溴化乙啶-氯化艷（EtBr-CsCl）梯度離心法、寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸[Oligo（dT）]-纖維素層析法、核酸固相抽提法、多效生物分子抽提法及自動(dòng)化抽提系統(tǒng)等，目前最常用的是熱裂解的方法。

（2）其他影響因素。當(dāng)然對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響還有包括儀器的差異、不同采光的原理、光源的強(qiáng)度。這里要強(qiáng)調(diào)光源的強(qiáng)度，因?yàn)闊晒釶CR儀器是通過光源照射以后來激發(fā)檢測(cè)的，那么該光源是有一定壽命的，如果光源使用時(shí)間比較長，光亮度不夠，那么檢測(cè)的信號(hào)也相應(yīng)會(huì)比較弱一些。

1.2.3污染與防污染措施

實(shí)驗(yàn)室防污染主要是：①防止核酸提取過程的外泄；②在試劑配制的過程中防止標(biāo)準(zhǔn)品的污染；③防止產(chǎn)物的外泄。實(shí)驗(yàn)室要嚴(yán)格分區(qū)管理，就是物理隔離、核酸提取和試劑配制不能在一起，試劑配制要盡可能在核酸提取之前，不要把核酸提取的物品帶到試劑配制室中。

其次，要嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，一定要有對(duì)流風(fēng)。一些實(shí)驗(yàn)室為了達(dá)到通風(fēng)目的，可以安裝排風(fēng)扇。實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)是防污染非常重要的方法。不要指望把污染物質(zhì)給清掉，而是應(yīng)該把它從實(shí)驗(yàn)室趕走。通過通風(fēng)的方式把實(shí)驗(yàn)室中的污染物質(zhì)帶走是最有效的方法。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，最早的設(shè)計(jì)是一個(gè)閉風(fēng)的狀態(tài)，現(xiàn)在已成為一種通風(fēng)的狀態(tài)。

2　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的應(yīng)用

當(dāng)前，國際社會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)路線主要有2條：一是對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)；二是直接檢測(cè)外源基因DNA。隨檢測(cè)手段不斷提高，對(duì)食品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)已從定性提高到定量水平。

近年來，有許多利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品文獻(xiàn)報(bào)道，陳穎等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過使用特異引物和探針，對(duì)玉米中內(nèi)源基因lnvertase、轉(zhuǎn)基因玉米Mon810、Event176外源基因進(jìn)行定量檢測(cè)，由此建立商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米Mon 810（YieldGard）和Event176（Maximizer）定量PCR檢測(cè)方法。該法檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.O1%，是國際上設(shè)定轉(zhuǎn)基因最低限量100倍。Hagen等研究表明，熒光定量PCR法可檢測(cè)出包括豆腐等在內(nèi)豆制品中轉(zhuǎn)基因成分含量；鄧鴻鈴等針對(duì)食用油脂中DNA含量極低、DNA序列片段短、破壞嚴(yán)重等特點(diǎn)，建立食用油脂DNA提取方法，通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)出大豆內(nèi)源基因及外源抗除草劑基因，為食用油脂進(jìn)行核酸類生物性檢測(cè)提供一種快捷有效方法。

3　展望

PCR技術(shù)在食品檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中，表現(xiàn)出靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)、簡便和高效等特點(diǎn)，為食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持，在食品致病菌、食品中有效成分、食品成分種類和轉(zhuǎn)基因食品等方面的檢測(cè)中具有重要的作用。但PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也表現(xiàn)出一些缺陷，但相信隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，各項(xiàng)新技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，以及PCR技術(shù)的進(jìn)一步完善和發(fā)展，其必將會(huì)得到更加普遍的推廣和發(fā)揮更大的效用，并在食品檢測(cè)和研究領(lǐng)域開辟一個(gè)新的應(yīng)用時(shí)代。

[1]翁文川，焦 紅，王方金，等.食品中副溶血弧菌熒光定量PCR方法快速檢測(cè)[J].中國公共衛(wèi)生，2005，21（11）：1359-1362.

[2張 霞，高旗利，羅茂凰，等.實(shí)時(shí)熒光PCR 對(duì)奶粉中坂崎腸桿菌的檢測(cè)[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（2）：214-216.

Application and Quality Control of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Detection Microbes in Foods

Mo Yichong
（Shanwei City Center for Disease Control and Prevention， Shanwei 516600， China）

The principles and characteristics of real-time fluorescence quantitative PCR technology，and its application and quality control statu of food microbiology detection， genetically modified food were reviewed， in order to provide the basis for food safety monitoring.

Real-time fluorescence quantitative PCR； Quantitative detection； Food microbe； Quality control

TS207.4

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.08.033