畜禽動物中長鏈非編碼RNA的研究現狀

戴夢紅，陸啟榮，程古月，李 麗，劉孟軻，郝海紅，王 旭，袁宗輝

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畜禽動物中長鏈非編碼RNA的研究現狀

戴夢紅，陸啟榮，程古月，李 麗，劉孟軻，郝海紅，王 旭，袁宗輝*

（華中農業大學動物醫學院/國家獸藥殘留基準實驗室（HZAU）/農業部畜禽產品質量安全風險評估實驗室（武漢）/農業部獸藥殘留檢測重點開放實驗室，武漢430070）

摘 要：長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt的非編碼RNA分子，它們以RNA的形式在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多層面調控基因的表達。它們參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學過程。近年來，lncRNA在畜禽動物中的研究越來越受到人們的重視，人們發現lncRNA在動物生長發育中扮演著很重要的角色。本文對近十五年來畜禽動物如豬、雞、羊和牛中lncRNA的高通量篩選與鑒定、表達、在不同物種中的進化以及功能等研究現狀進行綜述。

關鍵詞：LncRNA；畜禽動物；高通量篩選；表達；進化；功能

高通量RNA測序（RNA sequencing，RNA－seq）技術的出現，使人們認識到大約83.5%的人類基因組是可以轉錄的，其中轉錄物中只有1%～3%編碼蛋白［1－2］。這些可以發生轉錄的基因中80%是由非編碼RNA組成，它們的序列分別與內含子、順式調控元件和重復序列相對應［3］。基因組中大量的非編碼RNA基因的存在，說明它們可能在生命活動中扮演著很重要的角色，并不是人們最開始認為的那樣是基因轉錄過程中的“噪音”和“暗物質”。在這些非編碼RNA中，長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）是其中一種很重要的組成部分。近年來，lncRNA在畜禽動物中的研究也越來越受到人們的重視，人們發現lncRNA在動物生長發育中扮演著很重要的角色。在本文中，我們對近十五年來畜禽動物如豬、雞、羊和牛中傳統印記lncRNA的功能、新lncRNA的鑒定和功能、高通量篩選、在不同物種中的進化規律等研究現狀進行綜述。

1 LncRNA的分類和數目

LncRNA是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上如表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等調控基因的表達水平。

根據它們在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將其分為正義鏈（Sense）、反義鏈（Antisense）、雙向（Bidirectional）、內含子間（Intronic）、基因間（Intergenic）這5種類型［4］。這種位置關系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。但是，因為其功能多樣，且相對于microRNA和蛋白質而言其功能更加難以確定，目前并不能僅根據序列或者結構來推測它們的功能。

根據lncRNA的作用形式，可將其分為信號分子（Signal molecule）、誘餌分子（Decoy molecule）、引導分子（Guide molecule）和骨架分子（Scaffold molecule）等4類分子［5］。

根據http：//www.noncode.org/提供的NONCODE數據庫的最新記錄，目前已經發現的lncRNA達210 831條，其中人lncRNA為92 343條，小鼠的為67 628條。然而，根據LncRNA Disease數據庫的記錄，目前有功能和相關疾病報道的lncRNA只有1 600條左右，人們對其余99%以上的lncRNA的功能以及與人類疾病和動物發育的關系一無所知。雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但是絕大部分lncRNA的功能仍然是不清楚的。

2 畜禽動物中傳統印記lncRNA的功能

畜禽動物中早期的研究主要集中在與人和鼠同源的印記基因如H19、胰島素樣生長因子2（Insu－lin－like growth factor 2，IGF2）、X染色體滅活特異轉錄體（X－chromosome inactivation－specific transcript，XIST/Xist）、基因捕獲座位2（Gene trap locus 2，GTL2）、X染色體－關聯的單胺氧化酶A（X－linked monoamine oxidase type A，MAOA）等基因上，這些印記基因的表觀遺傳調控、表達和甲基化模式分析分別在畜禽如豬［6］、黃牛和野牛［7］、克隆綿羊［8］、克隆牛［9］、綿羊［10］、雞［11］等胚胎和組織中均有研究報道。

哺乳動物為二倍體生物，每個基因都是雙拷貝，一些基因的表達取決于來自父本還是母本，這種現象稱為基因印記，該現象涉及基因表達調控的遺傳。IGF2和H19基因參與了基因印記［12－13］。C.Li等對豬H19和IGF2這2個基因在13個組織中的印記狀況進行了探討，發現IGF2P1在所有組織中呈現雙等位基因表達，大多數的IGF2基因表達于啟動子2～4中，參與基因印記，而H19基因廣泛地表達于所有組織中的母本等位基因中［14］。這2個基因的甲基化模式研究在活的克隆豬和死豬的胎盤［15］、28天生長豬的單性胚胎和胎盤［16］、正常受精的豬胚胎和單性胚胎干細胞［17］也有報道。M.H.Braunschweig等闡明了豬IGF2印記狀態與H19甲基化結構域（DMD）和IGF2甲基化區域1、2 （DMR1和DMR2）的DNA甲基化的關系［18］。有研究指出，牛印記基因H19的表達、H19/IGF2印記控制區（Imprinting control region，ICR）的甲基化模式與人的相似［19］，IGF2－H19基因座的甲基化狀態不影響雜交公牛的生育能力［20］，但它們在利用體細胞核轉移技術生產的克隆牛中具有低甲基化趨勢［21］。還有很多研究針對利用體細胞核轉移克隆技術（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）生產的克隆動物中的印記基因的甲基化模式進行研究。在應用該技術產生的發生流產的轉基因克隆羊中H19和IGF2R基因產生了高甲基化模式，而存活克隆羊中的甲基化模式與自然生產羊的相似［22］。異常甲基化頻繁發生在克隆牛的3個印記基因IGF2、H19和XIST而不是衛星基因座上［23］。在含有β乳球蛋白（BLG）基因的克隆牛胎兒的耳朵成纖維細胞系（blg＋/－）中，6個基因（Beta－actin、VEGF、oct4、TERT、H19和Igf2）的DNA甲基化現象普遍存在，只是甲基化程度不一樣，這些變化可能會影響到基因的表達最終導致胎兒晚期發育的畸形和死亡［24］。在自然流產的克隆牛中4個印記基因（Peg3、MAOA、Xist和Peg10）的DNA甲基化異常，表現出不同程度的異常甲基化印記，說明印記基因的甲基化異常是導致克隆牛高流產率和發育異常的部分原因［25］。

3 畜禽動物中新lncRNA的鑒定和功能

近年來，隨著國際和國內對lncRNA研究的重視，畜牧行業的國內外研究者對該領域的關注度日益增高，lncRNA在畜禽方面的研究從十年前對典型印記基因的表觀遺傳調控研究逐漸轉向近年來對新lncRNA的鑒定和功能研究。有研究報道，在豬的胎兒滋養層鑒定出一種新的長鏈非編碼RNA，稱為TncRNA，并揭示了其染色體定位和二級結構。這種lncRNA在豬胎兒骨骼肌中上調表達，對豬胎兒骨骼肌的發育有顯著性影響［26］。豬lncRNA XIST的全長序列被鑒定出來，其基因全長25 215 bp，由7個外顯子組成，包括2個物種保守的和2個豬特異的重復區域。該基因存在于雌性細胞中，并受到其啟動子區域低水平CpG甲基化影響［27］。在豬克隆體細胞中XIST基因5′端存在一個差異甲基化區域，DNMT1抑制劑DNMTi scriptaid單獨或與組蛋白去乙酰化酶抑制劑HDACi RG108合用，可以改變XIST基因的轉錄和甲基化水平［28］。與此同時，在來自亞洲的Meishan豬和西方國家的White Composite（WC）豬的胎盤中鑒別出了一個具有種屬差異的lncRNA XIST同分異構體，與雌豬X染色體劑量補償效應有關［29］。最近，豬PU.1反義lncRNA（PU.1AS lncRNA）的作用機制被闡明，PU.1反義lncRNA通過形成PU.1mRNAPU.1AS lncRNA復合物促進豬脂肪的生成［30］。新的雞lncRNA的結構和功能也不斷地被發現和鑒定。Gomafu（也叫做RNCR2/MIAT）是一個非編碼RNA，是神經元的一個重要組成部分。研究表明，雞Gomafu RNA含有串連重復序列UACUAAC，該重復序列以很高的親和力結合到SF1剪接因子，影響到體外的剪接反應動力學［31］。雞lncRNA MHM在雞胚胎發育包括性腺發育中起作用［32］，而雞成年lncRNAα－球蛋白轉錄物（lncRNA－αGT）在雞發育晚期上調表達，可以完全激活成熟的α（D）球蛋白基因的表達并維持染色質的轉錄活性，說明lncRNA－αGT是α（D）球蛋白基因表達從胚胎到成熟過程中重要的一部分［33］。同期，在奶牛和水牛中發現了一個lncRNA LOC100848215。該基因只存在于奶牛和水牛中，在野生型角芽胚胎組織中高表達，這說明其參與牛角芽的形成［34］。現有的文獻表明，牛lncRNA可能參與牛母體早期胚胎發育的物質儲備［35－36］、牛胎兒的晚期發育［24］等。

4 畜禽動物中lncRNA的高通量篩選

近4年來研究者開始從全基因組角度對lncRNA進行高通量篩選。A.Esteve－Codina等利用高通量的RNA sequencing技術和生物信息學分析，在2種表型極端不同的公豬即Iberian和Large White基因組中鑒定出了2 047種lncRNAs，其中469種與人同源，但未對這些基因進行深入的功能分析［37］。2012年，W.Huang等利用已公布的牛特定的表達序列標簽，在405個基因間隔區篩選了449種lncRNAs，通過特征分析，結果表明這些lncRNAs一般以組織特異性方式表達，其GC含量高于隨機選擇的基因間序列，但比蛋白編碼基因的低，且在哺乳動物中比較保守［38］。T.Li等利用RNASeq技術和生物信息學分析，在雞基因組中鑒定了281種新的基因間lncRNAs，這些lncRNAs與雞骨骼肌發育相關，其序列保守性低于編碼基因序列［39］。R.Weikard等采用深度RNA sequencing方法分別對色素沉著和非色素沉著牛皮膚進行轉錄組測序，發現了4 848種lncRNAs，其中4 365種可能為基因間lncRNA，這些基因可能調控牛的皮膚色素沉著過程［40］。2014年中國科學院昆明動物研究所張亞平院士課題組通過整合NCBI EST數據和已發表的RNA－seq數據，鑒定了4 515個長鏈基因間非編碼RNAs（Large intergenic noncoding RNA，lincRNA）基因（6 621個lincRNAs轉錄本）。通過分析家豬和野豬的大腦表達數據，發現30個lincRNA基因在家豬和野豬大腦表現為表達差異，可能與從野豬到家豬的馴化行為轉變有關，其中lincsscg2561可能參與調控性情相關基因DNMT3A的表達。該研究為豬的基因組學研究以及家養動物馴化的分子機制研究提供重要信息［41］。胎牛、成年公牛、成年小母牛和成年去勢公牛4個文庫被構建用于Illumina二代測序，以對不同年齡不同性別牛脂肪組織發育過程中的轉錄復合體進行鑒定。結果發現，每個文庫鑒定出超過4 000個新的轉錄體，其中70%的為非編碼RNA，為后期的lncRNA研究提供了大量的信息［42］。Limousin公牛小腿最長肌中lincRNA也通過末端配對的RNA sequencing技術得以鑒定，鑒定出584種不同的lincRNAs，其中418種在所有9個肌肉樣品中均存在。這些lincRNAs具備跟其他哺乳動物中發現的lincRNAs一樣的特征：即與編碼基因比較，它們的長度相對較短、外顯子數量較少、表達量低得多。進一步分析發現，肌肉組織中部分基因間長鏈非編碼RNA位于跟肉品質相關的基因座上［43］。鄭竹清等以山羊肌內脂肪細胞成熟前后轉錄組數據，結合CPC（Coding potential calculator）與CPAT（Coding potential assessment tool）來預測lncRNA，并對其序列、結構與功能進行分析。結果表明，通過預測得到1 472個山羊肌內脂肪細胞中表達的lncRNA，其中29個lncRNA在成熟前后具有顯著差異，它們主要在細胞分泌、生長調節和細胞形態變化等方面發揮著重要作用［44］。這些研究結果為從lncRNAs的角度來研究家畜主要經濟性狀相關基因的功能和動物的生長發育機制開辟了新的途徑。

5 畜禽動物中lncRNA的進化規律

LncRNA在不同物種中均有發現，它們在不同物種中的進化規律也引起了人們的關注。有研究發現，在脊椎動物中，高度保守元件（HCEs）與調控基因的3′不譯區、穩定基因deserts以及在中度保守的非編碼序列中富含的兆堿基大小區域相關，非編碼的高度保守元件（HCEs）RNA的二級結構比較保守［45］。在雞的一段含有哺乳動物Ascl2/Mash2、Ins2和Igf2同源物的490kb基因組序列中未找到印記基因H19及其調控元件，但雞中與哺乳動物基因同源的ASCL2/CASH4和INS表現出雙等位基因表達，表明在哺乳動物和禽類動物中存在著印記進化［46］。在哺乳動物人、小鼠和牛的3′末端多聚腺苷酸位點上游存在著大約3 000種比較長的（30～500nt）非編碼保守片段，甚至在與哺乳動物親緣關系非常遠的動物鴨嘴獸中也存在著上千種這樣的片段。數量如此之大，即使這些序列的功能未知，但說明它們不可能作為蛋白質的識別位點（通常≤15 nt），可能與染色質易接近性（Chromatin accessibility）有關［47］。2014年A.Necsulea等對11種四足動物lncRNA的大規模進化和表達模式研究進行了系統分析，鑒定出了11 000個靈長類動物特有的lncRNAs和2 500個高度保守的lncRNAs，其中大約400個lncRNAs可能起源于3億年前［48］。對人lincRNAs在6個不同哺乳動物的9個不同組織中的進化史研究表明，在1 898種人lincRNAs中，80%的在黑猩猩，63%的在獼猴，39%的在牛，38%的在小鼠體內發現了同源物，并且表現出非常保守的組織特異性［49］。

6 小結與展望

LncRNA在家畜中的研究起步較晚，特別是功能與調控機制的研究剛剛起步。雖然lncRNA在遺傳信息中的作用日益受到研究人員的重視，但目前其在調控動物發育生長上的研究大都局限于表觀遺傳調控和克隆動物上，未見文獻對新發現的lncRNA在細胞生長調控以及與藥物作用的關系方面進行報道。對于畜禽lncRNA的研究可通過構建有共同特征的lncRNA文庫，利用RNA－seq技術對具有不同經濟性狀動物組織和細胞中的非編碼RNA測序和篩選，利用生物信息學方法預測lncRNA的結構特征，通過原位雜交技術FISH、過表達技術、RNAi技術來發現更多新的lncRNA，研究其對家畜生長或經濟性狀相關基因的調控作用機理，為加快家畜生長性狀改良，加快家畜育種進程提供一定的理論依據。我們相信隨著高通量測序技術的發展，越來越多的lncRNA被發現和注釋。然而，絕大多數lncRNA的功能效應及效應機制尚不得而知，探索這一廣闊的未知領域正逐漸成為生命科學研究的一個新熱點。

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（編輯 郭云雁）

The Progress on Long Noncoding RNAs in Farm Animals

DAI Meng－hong，LU Qi－rong，CHENG Gu－yue，LI Li，LIU Meng－ke，HAO Hai－hong，WANG Xu，YUAN Zong－hui*
（National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues（Huazhong Agricultural University）/Laboratory for Risk Assessment of Quality and Safety of Livestock and Poultry Products（Wuhan）of Ministry of Agriculture/Key Laboratory for Detection of Veterinary Drug Residues of Ministry of Agriculture/College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract：Long noncoding RNAs（lncRNAs）are a class of noncoding RNAs with longer in length than 200nucleotides that function is multifaceted in epigenetic regulation，transcriptional regulation and post－transcriptional regulation.LncRNAs have important roles in many biological processes including cell proliferation，differentiation and apoptosis.In recent years，more and more attention has been paid to the research of lncRNAs in farm animals.It is found that lncRNAs play important role in the growth and development of animals.In this review，we highlight the advances on the high throughput screening，identification，expression，evolution and function of lncRNAs in important farm animal species，such as pig，chicken，sheep and cattle in the past 15years.

Key words：long noncoding RNAs；farm animals；high throughput screening；expression；evolution；function

中圖分類號：S813.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0864－06

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.002

收稿日期：2015－09－15

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃“973”計劃（2013CB127201）

作者簡介：戴夢紅（1975－），女，湖北紅安人，副教授，博士，主要從事細菌耐藥性和抗菌藥物分子作用機理研究，E－mail：daimenghong@mail.hzau.edu.cn

*通信作者：袁宗輝，教授，博士生導師，E－mail：yuan5802@mail.hzau.edu.cn