兒茶素對胃癌細胞SGC-7901和MGC-803遷移及侵襲的影響*

杜培培,劉宗文,張　艷#,張鈺浩,尚淑芳,賈丹輝

1)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001　2)鄭州大學第二附屬醫院腫瘤放療科 鄭州 450014　3)鄭州大學臨床醫學系 鄭州 450052

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兒茶素對胃癌細胞SGC-7901和MGC-803遷移及侵襲的影響*

杜培培1),劉宗文2),張艷1)#,張鈺浩3),尚淑芳1),賈丹輝1)

1)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 4500012)鄭州大學第二附屬醫院腫瘤放療科 鄭州 4500143)鄭州大學臨床醫學系 鄭州 450052

關鍵詞胃癌；酸敏感離子通道；阿米洛利；兒茶素

摘要目的：探討兒茶素是否作用于酸敏感離子通道(ASICs)，進一步研究兒茶素是否通過ASICs對胃癌細胞遷移和侵襲產生影響。 方法：采用MTT法檢測兒茶素(0、50、100、200、400 μmol/L)對胃癌細胞SGC-7901和MGC-803增殖的影響。將細胞分為對照組，100 μmol/L阿米洛利組，50、100、200 μmol/L兒茶素組，采用免疫細胞化學方法檢測ASIC1的表達情況，Transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞的遷移和侵襲情況。采用全細胞膜片鉗技術觀察對照組、100 μmol/L阿米洛利組、400 μmol/L兒茶素組細胞的電流情況。 結果：ASIC1在各組細胞中均有表達，并且與SGC-7901細胞相比， MGC-803細胞中ASIC1的表達較低(P<0.05)；與對照組相比，兒茶素可以抑制ASIC1的表達，并且兒茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。與SGC-7901細胞相比，MGC-803細胞的侵襲和遷移能力較弱(P均<0.05)；與對照組相比，兒茶素可減弱2種胃癌細胞的侵襲能力和遷移能力，并且兒茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。MGC-803細胞的ASICs電流小于SGC-7901細胞的ASICs電流(P<0.05)；與對照組相比，兒茶素可使ASICs電流減弱，并且兒茶素的抑制作用弱于阿米洛利的抑制作用(P均<0.05)。結論：兒茶素可以通過抑制ASICs的表達抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。

AbstractAim: To investigate the effects of catechin on ASICs, and explore the effects of catechin on invasion and metastasis of gastric carcinoma cells． Methods: The SGC-7901 and MGC-803 cells were treated with 0,50,100,200,and 400 μmol/L catechin and the proliferation of the cells were observed by MTT.The SGC-7901 and MGC-803 cells were allocated into control group, 100 μmol/L amiloride group, 50, 100, 200 μmol/L catechin groups;the expression of ASIC1 protein was detected by immunocytochemistry,and the changes of cell invasion and metastasis were detected by wound-healing migration assay and Transwell migration assay, respectively. Finally, the ASICs current was analyzed by the whole cell patch clamp.Results: Expression of ASIC1 protein in MGC-803 cells was lower that in SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group, catechin reduced ASIC1 expression,and the inhibitive effect of catechin on ASIC1 expression was weaker than that of Amiloride (P<0.05). The invasion and metastasis ability of MGC-803 cells were weaker than that of SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group,catechin could reduce invasion and metastasis ability of MGC-803 and SGC-7901 cells, and the inhibitive effect of catechin was weaker than that of Amiloride(P<0.05). The ASICs current of MGC-803 was lower than that of SGC-7901 cells(P<0.05).Compared with the control group,catechin could reduce ASICs current of MGC-803 and SGC-7901 cells,and the inhibitive effect of catechin was weaker than that of Amiloride(P<0.05).Conclusion: Catechin could inhibit invasion and metastasis ability of gastric carcinoma cells by reducing the expression of ASICs.

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,復發率很高。研究[1]表明，胃癌的生物學行為與某些分子指標有關。胃癌侵襲轉移的程度是影響預后的主要因素[2],而腫瘤轉移的特性是腫瘤治療的難點[3]。腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個復雜和多步驟的連續發展過程[4]。研究[5]表明，組織酸化在腫瘤細胞的侵襲和轉移中起著至關重要的作用，而酸敏感離子通道(ASICs)是細胞膜上一類可以被酸性溶液直接激活的通道蛋白，抑制ASICs表達可以抑制膠質瘤細胞的侵襲轉移；阿米洛利作為ASICs的抑制劑可以減弱膠質瘤細胞的侵襲轉移。兒茶素是一種黃烷醇類化合物，具有較明顯的抗癌作用[6]，可抑制腫瘤增殖，促進腫瘤細胞的凋亡[7-10]；同時也可抑制腫瘤細胞的侵襲轉移[11-13]。該研究采用全細胞膜片鉗方法及體外侵襲生物學實驗觀察兒茶素對ASICs的作用，以及對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響，從而為兒茶素治療胃癌提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1細胞與試劑胃癌細胞(SGC-7901、MGC-803)由河南省醫學研究所饋贈。ASIC1抗體(北京博奧森生物有限公司)，阿米洛利、兒茶素(美國Sigma公司)。

1.2MTT法檢測胃癌細胞的生存率將2種胃癌細胞分別以 5×104mL-1接種在96孔板中；24 h后換為無血清DMEM高糖培養液，調整兒茶素濃度為0(對照)、50、100、200、400 μmol/L，各濃度設定培養時間為24 h；終止培養前4 h，每孔加20 μL MTT、150 μL二甲基亞砜，30 min后用酶標儀(檢測波長為490 nm)檢測各孔吸光度值,以對照組的細胞生存率為1計算2種細胞的生存率。實驗重復3次。

1.3免疫細胞化學方法檢測ASIC1的表達將2種胃癌細胞培養于24孔板中，調整阿米洛利終濃度為100 μmol/L，兒茶素終濃度為50、100、200 μmol/L，另設對照組和陰性對照組，培養48 h后用40 g/L的多聚甲醛固定20 min；按SP試劑盒說明進行操作；每張爬片觀察5個高倍視野,陽性細胞的胞膜和胞質為棕黃色，胞核為藍色，計數100個細胞中的陽性細胞數，計算陽性率。實驗重復3次。

1.4細胞遷移能力的測定參照文獻[14]，取2種胃癌細胞按每孔5×105個細胞接種于6孔板，劃痕，PBS清洗。加入含藥或者不含藥的無血清培養基(分組同1.3)，在 0、24 h 分別于倒置顯微鏡下拍照，與0 h比較計算24 h細胞遷移的距離，以SGC-7901對照組細胞的遷移率為1計算各組細胞的遷移率。實驗重復3次。

1.5細胞侵襲能力的測定參照文獻[15]，細胞分組同1.3，每孔加入16稀釋膠40 μL，放入37 ℃培養箱中30 min；調整細胞密度為1×106mL-1，每孔加200 μL細胞懸液；24孔板下室加含體積分數30%新生牛血清的DMEM培養基600 μL；200倍鏡下每孔取5個視野拍照，記錄穿膜細胞數并求平均值。實驗重復3次。

1.6全細胞膜片鉗觀察細胞的ASICs電流將細胞分為對照組、100 μmol/L阿米洛利組和400 μmol/L兒茶素組，培養24 h，待細胞貼壁且狀態良好時進行檢測。電極內液包含：100 mmol/L葡萄糖酸鉀、30 mmol/L KCl、10 mmol/L NaCl、20 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L EGTA、4 mmol/L ATPNa2；細胞外液包含：125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L NaH2PO4、10.5 mmol/L葡萄糖、32.5 mmol/L HEPES。實驗時將細胞置于35 mm培養皿中，加入細胞外液1 mL，放置在倒置顯微鏡平臺上；使充滿電極內液的玻璃微電極尖端吸附在細胞膜上，給予負壓，電壓鉗制在-60 mV,破膜5 min后開始檢測電流。實驗重復3次。

1.7統計學處理應用SPSS 19.0處理數據，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞生存率、ASIC1陽性表達率、遷移侵襲能力、ASICs電流的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1MTT法檢測不同濃度的兒茶素對胃癌細胞生存率的影響結果見表1。

表1　各組細胞生存率的比較(n=3)　%

*：與對照組相比，P<0.05。

A:對照組;B:陰性對照組;C:100 μmol/L阿米洛利組;D:50 μmol/L兒茶素組;E:100 μmol/L兒茶素組;F:200 μmol/L兒茶素組。圖1　各組SGC-7901細胞中ASIC1的表達(SP，×400)

2.2各組細胞中ASIC1的表達情況結果見圖1、2和表2。

A:對照組;B:陰性對照組;C:100 μmol/L阿米洛利組;D:50 μmol/L兒茶素組;E:100 μmol/L兒茶素組;F:200 μmol/L兒茶素組。圖2　各組MGC-803細胞中ASIC1的表達(SP，×400)

表2　各組細胞ASIC1陽性表達率的比較(n=3)　%

*：與對照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對照組相比，P<0.05。

2.3各組細胞遷移能力的比較結果見表3。

表3　各組細胞遷移率的比較(n=3)　%

*：與對照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對照組相比，P<0.05。

2.4各組細胞侵襲能力的比較結果見表4。

表4　各組細胞侵襲能力的比較(n=3)

*：與對照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對照組相比，P<0.05。

2.5各組細胞ASICs電流強度的比較結果見表5。

表5　各組細胞ASICs電流強度的比較(n=3)　pA

*：與對照組相比，P<0.05；#：與100 μmol/L阿米洛利組相比，P<0.05；▲：與SGC-7901對照組相比，P<0.05。

3討論

胃癌的復發率和病死率較高，其中胃癌的侵襲轉移是導致其復發的主要原因。侵襲轉移是惡性腫瘤的重要生物學行為,是影響抗腫瘤治療及預后的重要因素之一[16]。ASICs是細胞膜上由細胞外H+直接激活的通道蛋白，目前，已有6個ASICs亞基被克隆，分別是 ASIC1a、1b、2a、2b、3和4[17]。研究[18]表明其在腦缺血等伴有組織酸化的病理狀態中發揮作用，當腦缺血發生時，細胞周圍的pH從7.4降至6.0甚至更低，這樣就刺激ASIC1a開放，介導鈣內流，誘導神經元凋亡從而促使神經元損傷。研究[19]表明，組織酸化和乏氧是腫瘤微環境的重要生物學特征。腫瘤的微環境乏氧和酸化與腦缺血組織酸化具有相似的病理基礎。ASICs在神經膠質瘤細胞中有表達，它的表達與神經膠質瘤的發生發展密切相關[20]。也有研究[21]發現在腺樣囊性癌細胞和組織中均有ASICs的表達，但是在正常組織中并未見ASICs的明顯表達。

該研究中免疫細胞化學檢測結果顯示，在2種胃癌細胞SGC-7901和MGC-803中均有ASIC1的表達，說明ASICs可能與胃癌的發生發展有一定關系；SGC-7901細胞是中分化高轉移胃癌細胞，而MGC-803細胞是低轉移胃癌細胞，2種細胞的侵襲轉移能力有差別，推測胃癌細胞的侵襲轉移可能與ASICs的表達有一定關系。兒茶素是一種天然的植物提取藥物，有潛力成為抗癌藥物[22]，它可以抑制腦膠質瘤細胞U215的增殖[23], 在一定程度上也可抑制人肝癌細胞的增殖和遷移并誘導其凋亡[24]。該研究結果表明，兒茶素可以抑制胃癌細胞ASIC1的表達，減弱ASICs電流，并且還可抑制細胞的轉移和侵襲。這為臨床上采用兒茶素治療胃癌提供了一定的理論依據，但是具體機制還有待進一步的研究。

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Effects of catechin on invasion and metastasis in gastric carcinoma cells SGC-7901 and MGC-803

DUPeipei1),LIUZongwen2),ZHANGYan1),ZHANGYuhao3),SHANGShufang1),JIADanhui1)

1)DepartmentofPharmacology，CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofRadiationOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500143)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

*河南省高等學校重點科研項目基礎研究計劃基金資助項目15A310031；鄭州市科技創新團隊基金資助項目131PCXTD628

Key wordsgastric carcinoma;ASICs;amiloride;catechin

中圖分類號R735.2

通信作者#，女，1968年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail:zhangyan055@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.013 [8]RATHORE K,CHOUDHARY S,OA,et al.Green tea catechin intervention of reactive oxygen species-mediated ERK pathway activation and chronically induced breast cell carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2012,33(1):174