鹽酸普魯卡因對人白血病HL—60細胞ID4基因甲基化狀態的影響

林文遠　朱春江　劉馮　陳蓓莉　農慶偉　吳賢義

摘要：目的：探討鹽酸普魯卡因對體外培養的人白血病HL-60細胞ID4基因甲基化狀態的影響。方法：體外培養HL-60細胞，使用不同濃度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的普魯卡因處理細胞，分別采用MS-HRM、RT-PCR法檢測HL-60細胞ID4基因啟動子區域的甲基化狀態和ID4mRNA的表達。結果：HL-60細胞ID4基因在普魯卡因作用下呈現明顯的去甲基化狀態，ID4mRNA表達明顯增加，且以上改變均隨藥物濃度的增加而增強（P<0.05）。結論：鹽酸普魯卡因對HL-60細胞的ID4基因啟動子區域有去甲基化作用，上調細胞ID4 mRNA的表達。

關鍵詞：鹽酸普魯卡因；ID4基因；甲基化；HL-60細胞

中圖分類號：R733.7 文獻標志碼：A 文章編號：1008-2409（2016）05-0012-05

白血病是一類造血干細胞來源的惡性克隆性血液系統疾病，其發病機制尚不十分明確。研究認為DNA異常甲基化是血液系統惡性疾病發生、發展的重要機制之一，尤以抑癌基因的高甲基化最為重要。DNA結合抑制因子4（inhibitor of DNA binding，ID4）是一種新型的抑癌基因，其啟動子區域異常甲基化可致使該基因的表達沉默，并失去其抑癌作用，從而導致白血病的發生。鹽酸普魯卡因作為一種非核苷類去甲基化藥物，能夠使已發生甲基化的CPG島去甲基化，從而使沉默的抑癌基因重新表達，抑制腫瘤細胞增殖，促使其凋亡，進而達到治療腫瘤的目的。本研究主要是體外觀察鹽酸普魯卡因在不同濃度時人類白血病HL-60細胞ID4基因的甲基化狀態及ID4 mRNA表達的變化，探討普魯卡因對HL-60細胞ID4基因甲基化狀態的影響，為急性白血病的去甲基化治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1主要材料及來源

人類白血病HL-60細胞株購自中國科學院上海細胞庫；IMDM培養基為Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學社；倒置熒光顯微鏡為Nikon公司；全波長酶標儀為美國MD Company；引物由杭州赫貝生物技術有限公司合成；EpiTect Bisulfite kit（48）Cat.no-59104購自QiaGen公司；MS-HRM檢測試劑SsoFast Eva Green Supermix購自Bio-Rad公司；定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCRSystem，配套使用的分析軟件為BIO-RAD CFXManager（用于qPCR分析）及Precision Melt Analysis（用于HRM分析）；動物總RNA快速提取試劑盒購自Generay公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；qPCR試劑SuperReal Premix Plus（with SYBR Green I）購自TIANGEN公司；PVDF膜為Millipore公司；ECL Plus發光試劑盒購自碧云天公司；ID4 antibody購于Santa Cruz公司；GAPDH antibody購于Bioworld公司。

1.2細胞培養與用藥分組

HL-60細胞株置于IMDM培養基（含20%胎牛血清），在37℃、5%CO₂、飽和濕度的培養箱中進行傳代培養。使用普魯卡因2，4，6mmol/L處理細胞，并設0mmol/L為空白對照組。

1.3甲基化敏感性高分辨率溶解曲線分析法（MS-HRM）

分別提取普魯卡因處理前及處理48 h后各組細胞DNA，Merinton SMA4000檢測DNA濃度，按EpiTect Bisulfite kit（Cat.no-59104）說明書進行DNA的亞硫酸鹽修飾及純化，以純化后的DNA為模板進行PCR擴增反應，上游引物：5′GATYATATTTTGGATTTGTAGTTGG3′，下游引物：5′CpG 196R：AAAAAACTATCATFCCTAACCC3′，PCR反應體系：SsoFast Eva Green Supermix 10μl、上下游引物各1μl（10μmol）、雙蒸水6μl、DNA模板1μl。反應條件：95.0℃預變性5 min，95.0℃10 s、59.0℃15 s、72.0℃20 s，進行40個循環，72.0℃延伸10 min。使用Precision Melt Analysis分析軟件檢測各組ID4甲基化程度。

1.4 RT-PCR法檢測ID4 mRNA表達

Trizol一步法分別提取普魯卡因處理前和處理48 h后各組細胞RNA，分光光度計檢測其濃度及純度，將RNA逆轉錄形成cDNA后進行PCR擴增，用GAPDH進行校正。ID4上游引物：5′CTGTGCCTGCAGTGCGATA3′，下游引物：5′CAGGTCCAGGATGTAGTCGATAA3′，目的產物大小為129 bp；GAPDH上游引物：5′AGAAGGCTGGGGCTCATITG3′，下游引物：5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′，目的產物大小為258 bp。反應體系：SuperReal Premix Plus10μl、上下游引物各1μl（10 μmol）、cDNA模板8μl。反應條件：95.0℃預變性15 min，95.0℃10 s，60.0℃15 s，72.0℃20 s，45個循環，最后72.0℃延伸10 min。使用熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager進行統計和計算。

1.5統計學方法

使用SPSS 13.0軟件分析處理數據，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1普魯卡因對HL-60細胞ID4基因甲基化狀態的影響

用100%和0%的甲基化標準品做MS-HRM分析，所檢測ID4樣本的曲線越靠近100%說明甲基化程度越高，相反越靠近0%說明甲基化程度越低。在普魯卡因處理前，HL-60細胞ID4基因處于完全甲基化狀態。在經普魯卡因處理后，細胞ID4基因呈現去甲基化狀態，去甲基化程度隨著藥物濃度不斷增大而增加，圖1中2 mmol/L組多在1區范圍，4 mmol/L及6 mmol/L組多在2區及3區范圍，去甲基化程度均明顯強于前者。詳見圖1。

2.2普魯卡因對HL-60細胞ID4基因mRNA及蛋白表達的影響

HL-60細胞經普魯卡因處理48 h后，細胞ID4基因mRNA及蛋白的表達量均較對照組明顯增加，且兩者的表達量均隨藥物濃度的增大而不斷增加，各濃度組之間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。詳見表1。

3討論

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，指在DNA甲基轉移酶的作用下，以s腺苷甲硫氨酸為供體將甲基轉移到胞嘧啶第5位碳原子上的過程。它在基因表達、基因組印記、X染色體滅活及維持染色體完整性等多種生物學過程中發揮著重要作用。研究表明，DNA的異常甲基化可導致癌基因的激活和抑癌基因的沉默，與多種腫瘤的發生、發展密切相關。近年來，DNA甲基化尤其抑癌基因啟動子區域的高甲基化的研究在白血病的發生發展、診斷、病情預測和指導治療等方面都具有重要意義。

人類ID4基因位于6p21.3-p22號染色體上，其編碼的ID4蛋白屬于螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉錄因子的成員，因其缺乏富含堿性氨基酸的DNA結合域，本身并不能與DNA結合，但它可以通過與堿性HLH（bHLH）蛋白形成異二聚體而抑制其與DNA的結合，是bHLH轉錄因子的負性調節物。bHLH的高表達可促進干細胞向終末細胞分化，低表達則抑制干細胞分化使其處于持續增殖狀態。ID4基因廣泛表達于人體正常組織細胞中，并參與細胞增殖、分化的調控。ID4在不同來源、不同性質的腫瘤組織中表達程度不同，既可作為癌基因，又可作為抑癌基因，與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。研究發現，在神經系統腫瘤及卵巢癌中的ID4基因呈現高表達，其能夠抑制細胞分化、促進細胞增殖，對腫瘤的形成起促進作用；而在大部分血液系統腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤中，ID4基因卻表現為抑癌作用。在人類急性白血病細胞中普遍存在ID4基因啟動子區域的甲基化，檢測ID4基因的甲基化狀態有助于評估急性白血病預后及復發。于力等研究發現，在小鼠白血病模型中，ID4基因啟動子區域的DNA呈現出高甲基化的狀態并導致基因表達沉默，而在正常小鼠的骨髓細胞中該基因處于非甲基化狀態。應用逆轉錄病毒將ID4基因的蛋白編碼序列轉入小鼠白血病T細胞惡性腫瘤細胞系YAC-1后，在體外細胞培養及在免疫缺陷鼠皮下接種，均發現白血病細胞ID4基因表達增加，并出現了腫瘤細胞生長受抑和凋亡增加，因此，首次提出了ID4是一種新型的抑癌基因。

由于DNA甲基化并未改變DNA序列及遺傳密碼，因此，該過程具有可逆性。目前，對于去甲基化藥物的研究主要集中在兩個方面：一類是核苷類似物，如5-氮-2-脫氧胞苷等，能參與快速增長的腫瘤細胞的DNA合成，通過占有、消耗DNA甲基轉移酶（DNMTs）特異性地抑制DNA甲基化。另一類是非核苷類似物，如普魯卡因。普魯卡因是一種非共價結合的非核苷類DNMTs抑制劑，其可通過與DNA的CPG島高特異地結合，直接干擾DNMTs與DNA的結合位點，使超甲基化的CPG島去甲基化，從而使沉默的抑癌基因重新表達，發揮抗腫瘤的作用，同時避免了核苷類DNMTs抑制劑與酶共價結合帶來的骨髓抑制等毒性反應。普魯卡因能使人鼻咽癌CNE-2Z細胞的抑癌基因RASSF1A去甲基化，促其mRNA的表達增加，抑制了CNE-2Z細胞的增殖。鹽酸普魯卡因能夠逆轉人肝癌HepG2細胞Syk基因啟動子區域CPG島的甲基化，恢復Syk基因的活性并上調Syk蛋白的表達，抑制了肝癌細胞的增殖。

本實驗結果顯示，未經鹽酸普魯卡因處理的HL-60細胞ID4基因處于高甲基化狀態，ID4mRNA及ID4蛋白的表達均處于低水平狀態，經藥物處理48 h后細胞ID4基因出現明顯的去甲基化狀態，ID4 mRNA及ID4蛋白表達均明顯增加，隨著藥物濃度的增加，去甲基化的程度和ID4蛋白的表達在不斷增加。上述結果表明HL-60細胞ID4基因的表達受基因啟動子區域甲基化的調控，鹽酸普魯卡因能夠使ID4基因啟動子區域發生去甲基化，從而恢復基因的活性，上調ID4蛋白的表達，達到抑制腫瘤細胞的作用，并且這種效應可隨藥物濃度的增加而增強。

急性白血病及淋巴瘤的ID4基因啟動子區域的異常甲基化可使該基因表達沉默，失去其抑癌作用而導致血液腫瘤的發生與進展。本研究中，鹽酸普魯卡因能夠逆轉白血病HL-60細胞ID4基因啟動子區域的高甲基化狀態，從而恢復ID4基因的表達，并對HL-60細胞的生長起到抑制作用。對于非核苷類藥物鹽酸普魯卡因的去甲基化作用，如何更好地發揮其抗腫瘤效應需進一步的探索。