VEGFR基因表達與接受恩度治療的Ⅲa期非小細胞肺癌療效相關性研究*

楊曉軍，李 強△，莊 翔，何金濤，周紅艷，朱 江，謝天鵬，肖 平，榮 昊

（1.四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，成都610041；2.四川省腫瘤醫(yī)院科教部，成都610041）

VEGFR基因表達與接受恩度治療的Ⅲa期非小細胞肺癌療效相關性研究*

楊曉軍1，李 強1△，莊 翔1，何金濤1，周紅艷2，朱 江1，謝天鵬1，肖 平1，榮 昊1

（1.四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，成都610041；2.四川省腫瘤醫(yī)院科教部，成都610041）

目的：探討Ⅲa期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者腫瘤組織中血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）mRNA表達水平與重組人血管內皮抑制素注射液（商品名恩度，Endostar）輔助治療療效的相關性。方法：通過分支DNA－液相芯片法檢測29例Ⅲa期NSCLC患者組織中VEGFR mRNA表達水平，分析VEGFR1和VEGFR2基因mRNA表達水平與手術后接受恩度聯合GP方案化療患者復發(fā)轉移的相關性。結果：以1年復發(fā)轉移率為本研究終點，VEGFR1在復發(fā)轉移組中的表達范圍4.0%～86.0%，中位表達48.9%；無復發(fā)轉移組中的表達范圍16.1%～73.5%，中位表達52.6%，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝2.225，P＝0.013）。VEGFR2在無復發(fā)轉移組中的表達范圍1.0%～93.0%，中位表達46.9%；復發(fā)轉移組中的表達范圍11.7%～72.6%，中位表達36.2%，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝2.12，P＝0.017）。結論：Ⅲa期NSCLC腫瘤組織中VEGFR mRNA高表達的患者在接受恩度輔助治療后復發(fā)轉移率更低，提示VEGFR mRNA表達水平可作為恩度的療效預測因子，可作為篩選恩度輔助治療獲益人群的指標。

非小細胞肺癌；Ⅲa期；血管內皮生長因子受體1；血管內皮生長因子受體2；血管內皮抑制素

肺癌是世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占全部肺癌的80%左右，大約30%的NSCLC患者在最初診斷時已經處于局部晚期（Ⅲa期/Ⅲb期），而Ⅲ期NSCLC切除術后的5年生存率僅為13%～36%，所以Ⅲ期肺癌的治療一直是肺癌治療領域的難點［1－2］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被公認是最重要的促進血管新生的因子之一，其受體VEGFR1、VEGFR2與血管的生成關系密切，是目前抗血管生成抑制劑的主要靶點［3］。常見的血管抑制劑類藥物有單抗類的貝伐單抗和多靶點的小分子抑制劑索拉菲尼等。重組人血管內皮抑制素（恩度）是中國自主研發(fā)的一類新藥，其作用機理是通過抑制形成血管的內皮細胞遷移來達到抑制腫瘤新生血管的生成，從而阻斷了腫瘤的營養(yǎng)供給，達到抑制腫瘤增殖或轉移目的。作為一種血管抑制類新生物制品，該藥已經作為聯合化療用藥廣泛應用于晚期肺癌的綜合治療，也為Ⅲa期肺癌的輔助治療帶來了一定的進展。

恩度通過誘導血管內皮細胞凋亡，細胞周期阻滯等來破壞腫瘤中的血管結構，抑制腫瘤血管的生成，從而切斷腫瘤的血液供應來達到抑制腫瘤的目的。所以恩度潛在的療效預測因子可能與血管內皮生長因子受體相關，即VEGFR基因mRNA表達也許能預測恩度的療效。因此，本研究擬對接受含恩度治療的Ⅲa期非小細胞肺癌患者進行VEGFR基因mRNA表達水平的研究，以1年復發(fā)轉移率為終點評價指標［3］，探尋VEGFR基因mRNA表達水平與恩度治療療效的相關性，為Ⅲa期肺癌患者的個性化輔助治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年11月至2013年3月就診于四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，經過病理學及影像學確診為Ⅲa期的NSCLC患者29例，年齡42～80歲，中位年齡60歲。腺癌18例，鱗癌9例，腺鱗癌2例；男性19例，女性10例。所有患者行根治性手術，患者身體狀況評分ECOG 0～1，既往未接受過放化療，術后輔助治療前檢查結果證實患者的血常規(guī)、肝功能、腎功能及心臟功能等均在正常范圍值內。術后采用吉西他濱（1 250mg/m2，d1）+順鉑（80～120mg/m2，d1）+恩度（7.5mg/m2，d1－14d）方案化療?；煼桨傅闹芷陂g隔21天，共進行4個周期化療。

1.2 方法

1.2.1 檢測腫瘤組織中VEGFR mRNA表達水平

采用分支DNA－液相芯片技術。所有患者獲取的腫瘤石蠟塊組織進行VEGFR mRNA表達檢測：1）標本用75%乙醇固定，取適量樣本加入裂解液，56℃下裂解反應2小時；2）將樣本裂解液轉移至孵育板上，加入支持探針－微球、支持延伸探針、緩沖液，55℃震蕩孵育過夜；3）次日將孵育板放在磁力架上1分鐘，此時磁性微球聚集在底部，吸取棄去上清；4）加入洗滌液，震蕩洗滌1分鐘，孵育板放在磁力架上1分鐘，吸取棄去上清，重復洗3次；5）加入擴增延伸探針和標記探針，50℃震蕩反應1小時；6）孵育板放在磁力架上1分鐘，吸取棄去上清，用洗滌液洗2次；7）加入鏈霉親和素－藻紅蛋白，50℃震蕩反應30分鐘；8）孵育板放在磁力架上1分鐘，吸取棄去上清，用洗滌液洗2次；9）加入洗滌液，震蕩5分鐘，于Luminex閱讀儀上讀取數據；10）數據分析，得出檢測結果。

1.2.2 檢測結果的表現形式及判定 患者的基因表達水平檢測數據顯示的百分比為患者該基因表達水平在同類癌種人群中所處的位置，即所得的數值是患者基因表達水平在整個肺癌人群中的分布情況，以表明該患者在整個肺癌人群中處于怎樣的水平，可劃分為低、中、高三個表達水平，采用四分位法且合并，＜37.5%為低表達；37.5%～62.5%為中表達；＞62.5%為高表達，參考益善生物檢測人群數據庫，數據庫為數千例的中國肺癌人群數據庫。

1.3 統(tǒng)計學分析

以1年復發(fā)轉移率為研究終點，出現復發(fā)或轉移的患者稱為復發(fā)轉移組，而無復發(fā)或轉移的患者稱為無復發(fā)轉移組，用非參數檢驗法比較VEGFR1和VEGFR2在復發(fā)轉移組與非復發(fā)轉移組的表達差異是否有統(tǒng)計學意義，即采用計數資料t檢驗，應用SPSS 17.0軟件進行分析，檢驗水準P＜0.05，均為雙側檢驗有意義。

2 結 果

2.1 VEGFR1和VEGFR2基因m RNA表達水平

在29例Ⅲa期NSCLC患者腫瘤組織樣本檢測了VEGFR1和VEGFR2基因的mRNA表達水平。VEGFR1低表達11例（37.9%），中表達8例（27.6%），高表達10例（34.5%）。VEGFR2低表達13例（44.8%），中表達10例（34.5%），高表達6例（20.7%）。

2.2 VEGFR1和VEGFR2基因mRNA表達與恩度療效的相關性

以1年復發(fā)率為療效評估指標，隨訪期內，有7例（24.1%）出現復發(fā)或轉移，其中復發(fā)4例，腦轉移2例，骨轉移1例。VEGFR1在復發(fā)轉移組中的表達范圍4.0%～86.0%，中位表達48.9%；無復發(fā)轉移組中的表達范圍16.1%～73.5%，中位表達52.6%，VEGFR1在復發(fā)轉移組和無復發(fā)轉移組中表達差異有統(tǒng)計學意義（Z＝2.225，P＝0.013）。VEGFR2在復發(fā)轉移組中的表達范圍11.7%～72.6%，中位表達36.2%；無復發(fā)轉移組中的表達范圍1.0%～93.0%，中位表達46.9%；VEGFR2在復發(fā)轉移組和無復發(fā)轉移組中表達差異有統(tǒng)計學意義（Z＝2.12，P＝0.017）。

圖1 VEGFR1 mRNA在無復發(fā)轉移組和復發(fā)轉移組中的表達水平

圖2 VEGFR2 mRNA在無復發(fā)轉移組和復發(fā)轉移組中的表達水平

3 討 論

雖然輔助治療可能消滅殘存的微小轉移病灶，減少腫瘤復發(fā)和轉移的機會，但是根據臨床結果顯示，術后接受輔助治療的腫瘤患者的治療有效率仍然有限，多數患者接受的化療療效甚微，而且有時毒副作用對患者會產生不良影響。所以，尋找藥物療效預測的生物標記從而選擇患者接受合適的治療，在提高治療有效率的同時，盡量減少不必要的化療毒副作用的困擾是十分有意義的。近年來，藥物遺傳學和藥物基因組學在化療藥物作用機制等方面的研究取得了突破性進展，相關的臨床研究也不斷深入。先通過相關基因的檢測，再根據檢測結果選擇合適的藥物進行個體化治療，或將成為腫瘤治療的一種發(fā)展趨勢。

腫瘤生長需要依賴腫瘤血管的生成，所以通過抑制腫瘤新生血管可以達到控制腫瘤的目的。VEGF是腫瘤新生血管形成的最有效和最特異的因子，它可以促進血管內皮細胞分裂增殖，增加微靜脈和小靜脈的通透性，VEGF表達在腫瘤生長和轉移中具有十分重要的作用。VEGFR是VEGF的受體，VEGF和VEGFR結合后可引發(fā)內皮細胞的一系列變化，促進腫瘤血管生成、浸潤和轉移。療效預測方面，VEGFR1 mRNA表達水平檢測對結直腸癌患者接受抗血管生成抑制劑治療具有明顯的指導意義。Dan等［4］一項對接受貝伐單抗聯合化療治療的局部直腸癌患者的研究中，發(fā)現血漿可溶性VEGFR1水平（sVEGFR1）與接受貝伐單抗聯合放化療的新輔助治療后的原發(fā)灶縮小和副作用的發(fā)展相關，推測血漿中sVEGFR1的表達水平是貝伐單抗和/或新輔助治療中細胞毒副作用的生物標志物。該研究表明，VEGFR基因表達與抗血管生成抑制劑的療效呈現相關關系。而在肺癌中VEGFR2的過表達會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，導致更差的預后［5］。本研究報道了VEGFR基因表達與含恩度的Ⅲa期肺癌輔助治療療效的相關性。研究結果顯示VEGFR1和VEGFR2基因高表達的患者在接受恩度輔助治療后復發(fā)轉移率更低，樣示VEGFRmRNA表達水平可能是血管內皮抑素恩度潛在的療效預測因子，其表達量的高低影響患者術后接受恩度聯合GP輔助治療后1年復發(fā)轉移率。基于本研究的觀察結果，表明VEGFR基因表達與血管抑制劑的療效具有一定相關性，為恩度等血管抑制劑的敏感人群篩選提供了一個新的思路和方向。

本文采用的實驗方法為分支DNA－液相芯片技術，它是一種廣泛應用于臨床的基因表達檢測技術，在基因檢測方面與傳統(tǒng)方法無論是RT－PCR還是固相芯片比較都有明顯優(yōu)勢。樣本無論是新鮮組織還是石蠟包埋塊組織都可以進行mRNA表達水平檢測，整個過程中無需進行RNA抽提、純化和逆轉錄等步驟即可實現對mRNA表達水平的直接檢測，檢測結果基本不受樣品中RNA降解等因素的影響，相比于傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR，更保證了檢測結果的準確性［6］。

鑒于本研究樣本量少，且為回顧性研究，入組患者隨訪時間較短，無法就患者生存預后狀況做出有力的統(tǒng)計學證明。因此有必要進行長期的隨訪研究比較不同VEGFR表達水平的患者的臨床療效差異。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現的不端行為承擔相應責任。

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突。

學術不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網（CNKI）科技期刊學術不端文獻檢測系統(tǒng)學術不端檢測。

同行評議：經同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。

［1］ NK Veeramachaneni，RH Feins，BJ Stephenson，et al.Management of stage ⅢA non-small cell lung cancer by thoracic surgeons in north america［J］.Ann Thorac Surg，2012，94（3）：922－926.

［2］ 劉慧慧，王孟昭，胡 克，等.Ⅲ期非小細胞肺癌手術是否有價值［J］.中國肺癌雜志，2013，16（12）：639－645.

［3］ 李春鳴，余更生.肺癌術后局部復發(fā)和遠處轉移相關因素的差異性分析［J］.當代醫(yī)學，2013，19（24）：9－10.

［4］ Dan GD，Willett CG，Ancukiewicz M，et al.Plasma soluble VEGFR－1 is a potential dual biomarker of response and toxicity for bevacizumab with chemoradiation in locally advanced rectal cancer［J］.Oncologist，2010，15（6）：577－583.

［5］ 蔣曉東，戴 鵬，宋大安，等.HIF－1a、VEGF、VEGFR2在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2011，16（3）：386－388.

［6］ 胡艷正，王 偉，尚立群，等.液相芯片與免疫組織化學方法檢測非小細胞肺癌ERCC1和RRM1表達的比較研究［J］.中國腫瘤臨床，2013，12（6）：349－353.

R734.2；R730.5

B

10.3969/j.issn.1674-0904.2016.06.005

2015-05-14

2016-11-17

*四川省科技支撐計劃（編號：2011FZ0069）

楊曉軍（1969－），男，四川人，本科，副主任醫(yī)師，主要研究方向：肺癌的綜合治療。

△李 強，主任醫(yī)師，E-mail：liqiang201320＠163.com