腫瘤相關巨噬細胞和CCL5在胃癌中的表達及其相關性研究①

丁海霞　趙連梅　單保恩

(河北醫科大學第四醫院腫瘤研究中心，石家莊050000)

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腫瘤相關巨噬細胞和CCL5在胃癌中的表達及其相關性研究①

丁海霞趙連梅單保恩②

(河北醫科大學第四醫院腫瘤研究中心，石家莊050000)

指導教師：趙連梅(1981年-)，女，醫學博士，助理研究員，主要從事免疫基礎研究。

[摘要]目的：研究胃癌中腫瘤相關巨噬細胞(TAM)與CCL5的表達及其相關性。方法：選擇臨床病理資料齊全的胃癌蠟塊標本48例，癌旁組織作為對照，采用SP免疫組化法檢測CD68和CCL5在胃癌組織及癌旁組織中的表達，并采用Spearman相關性統計方法對其相關性進行統計。結果：CD68和CCL5在胃癌組織中均呈陽性表達，且明顯高于癌旁組織(P<0.01)；CD68和CCL5與胃癌組織浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期情況及腫瘤分化程度均具有相關性(P<0.001)，且胃癌中CD68和CCL5的表達程度呈正相關(P<0.01，r=0.759)。 結論：CD68和CCL5 對胃癌的發生、侵襲和轉移起重要的促進作用，提示TAM分泌的CCL5可能促進胃癌侵襲轉移。

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，生長迅速，晚期預后差，研究顯示腫瘤相關巨噬細胞參與癌癥發病的各個環節[1]，CD68陽性的巨噬細胞可作為胃癌根治性切除術后預后的獨立危險因素[2]。胃癌微環境能夠誘導巨噬細胞分化,而活化的巨噬細胞，尤其是腫瘤相關巨噬細胞通過分泌多種活性物質在局部促進腫瘤生長、侵襲和轉移，在其分泌的活性物質中，細胞因子和趨化因子扮演了重要的角色。Wu等[3]報道了腫瘤相關巨噬細胞通過VEGF 和VEGF-C的表達促進胃癌的血管新生及淋巴結轉移。有學者發現腫瘤相關巨噬細胞可能通過分泌CCL2和CCL5促進乳腺癌的轉移[4]，而后逐漸在血液系統惡性腫瘤、淋巴瘤、大量實體瘤中發現了趨化因子及其配體[5-9]，CCL5作為趨化性細胞因子CC 亞族的成員之一，能夠趨化腫瘤細胞及其他炎性細胞，并可調節金屬蛋白酶及黏附分子表達增加細胞侵襲性[8]。國外有學者對胃癌患者血清中CCL5的表達進行了研究，發現血清中CCL5的表達與胃癌的發生、發展和轉移密切相關[10]，而國內尚無此類報道。CD68是胃癌腫瘤相關性巨噬細胞的標志物，本研究應用免疫組化法檢測CCL5在胃癌腫瘤相關巨噬細胞中的表達，通過對CCL5與CD68的關系進行探討，證明CCL5可能是TAM促進胃癌侵襲轉移的重要趨化因子之一，從而為胃癌的治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料胃癌組織取材于河北醫科大學第四醫院2013年48例胃癌患者，其中男28例，女20例，年齡50~75歲。術前均未行放化療及其他抗腫瘤治療，術后依照美國癌癥聯合委員會(AJCC)制定的胃癌TNM分期第七版標準記錄病理類型、臨床分期及分化類型。

1.1.2主要試劑CD68兔抗人單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology corporation，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋科技公司，CCL5兔抗人單克隆抗體購自上海拜力生物科技有限公司，SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋科技公司。

1.2方法常規HE染色，確定標本的組織分化程度，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)免疫組織化學法檢測CD68和CCL5在胃癌組織和癌旁組織中的表達。石蠟切片，常規脫蠟、水化組織切片，采用枸櫞酸鹽緩沖液煮沸熱修復30 min后冷卻至室溫，3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗2×3 min；1∶100滴加一抗4℃冰箱過夜，PBS沖洗2×3 min；滴加二抗,37℃30 min,PBS沖洗2×3 min;DAB顯色，充分沖洗后，常規脫水，透明，干燥，封片。

結果判定：依照細胞陽性著色程度(抗原含量)，可分為：弱陽性(+)┅1分；中等陽性(++)┅2分；強陽性(+++)┅3分。依照陽性細胞數量，可分為：弱陽性(+ ，指陽性細胞總數在25%以下)；中等陽性(++,指陽性細胞總數在25%~49%)；強陽性(+++ ，指陽性細胞總數在50%以上)。 目前多采用積分綜合計量。計算公式為：(+)%×1 +(++)%×2+(+++)%×3；總數值<1.0者為(+)記為1分，1.0~1.5者為(++)記為2分,>1.5者為(+++)記為3分，表達陰性者記為0分。至少隨機觀察5~10個HPF。

1.3統計學方法應用SPSS13.0軟件進行統計學處理，CD68和CCL5在癌和癌旁組織的表達差異采用配對設計的t檢驗，與病理因素的相關性采用R×C的χ2進行檢驗，組間相關性采用Spearman相關分析，P<0.01有統計學意義。

2結果

2.1CD68在胃癌和癌旁組織中的表達CD68在胃癌組織的巨噬細胞均呈陽性表達，胞漿內含清晰的黃色或黃褐色顆粒者視為陽性，見圖1箭頭所示。在癌旁組織中僅1例呈弱陽性表達，根據病理評分，行配對t檢驗，具有明顯統計學差異(P<0.01)，CD68的陽性表達程度與胃癌組織大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期情況、遠處轉移呈正相關性，與年齡、性別無相關性，見表1。

表1CD68在胃癌中的表達及與病理因素的關系[n(%)]

Tab.1Relationship between expression and pathological factors of CD68 in gastric cancer[n(%)]

FeaturenExpressiondegreesandProportionofCD68++++++Pχ2Age(year)≤6520866>0.010.223>652811710GenderMale289109>0.012.817Female207310Tumorsize(cm)≤5221363<0.0114.422>5264517InvasiondepthT1+T2221642<0.0126.757T3+T4263221DegreeofdifferentiationHigh241572<0.0111.297Low245811LymphnodemetastasisNo201361<0.0119.360Yes285419PathologicalgradeⅠ-Ⅱ211452<0.0121.423Ⅲ-Ⅳ274320TumorthrombusNo181242<0.019.695Yes308616EnvelopWithout93420.0197.109Witp94827

圖1　CD68在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況(SP,×200)Fig.1　Expression of CD68 in gastric cancer and precancerous tissues(SP,×200)Note: A.Grade-；B.Grade+；C.Grade++；D.Grade+++.A for precancerous tissues;B-D for cancer tissues.

圖2　CCL5在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況(SP,×200)Fig.2　Expression of CCL5 in gastric cancer and precancerous tissues(SP,×200)Note: A.Grade-；B.Grade+；C.Grade++；D.Grade+++.A for precancerous tissues;B-D for cancer tissues.

表2CCL5在胃癌中的表達及與病理因素的關系[n(%)]

Tab.2Relationship between expression and pathological factors of CCL5 in gastric cancer[n(%)]

FeaturenExpressiondegreesandproportionofCCL5++++++Pχ2Age(year)≤6520956>0.010.423>652810810GenderMale289910>0.012.313Female201037Tumorsize(cm)≤5221264<0.0113.206>5263617InvasiondepthT1+T2221651<0.0132.510T3+T4262321DegreeofdifferentiationHigh241563<0.0110.477Low245712LymphnodemetastasisNo201271<0.0118.467Yes284618PathologicalgradeⅠ-Ⅱ211443<0.0119.924Ⅲ-Ⅳ273420TumorthrombusNo181152<0.019.937Yes308517EnvelopWithout94230.0644.636Witp95925

圖3　CCL5與CD68在胃癌中表達的相關性(r=0.759)Fig.3　Correlation between CCL5 and CD68 in gastric cancer(r=0.759)Note: Spearman correlation analysis suggested the expression of CD68 and CCL5 in gastric carcer tissues was positively correlated(r=0.759,P<0.01).

2.2CCL5在胃癌和癌旁組織中的表達CCL5在胃癌組織中呈陽性表達，胞漿內含清晰的黃色或黃褐色顆粒者視為陽性，癌旁組織中為陰性表達，見圖2箭頭所示。根據病理評分，行配對t檢驗，具有明顯統計學差異(P<0.01)，CCL5的陽性表達程度與胃癌組織浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期情況及腫瘤分化程度呈正相關性，與年齡、性別、遠處轉移無相關性，見表2。

2.3CCL5與CD68在胃癌中表達的相關性研究經Spearman相關分析，胃癌組織中CCL5與CD68的表達有顯著的相關性，且呈正相關(r=0.759),見圖3。

3討論

侵襲、轉移使得胃癌死亡率不斷上升，而且行胃癌根治性切除術后患者復發轉移的幾率仍然很大[11]。因此目前對胃癌的靶向治療逐漸成為人們關注的焦點。而靶向治療的關鍵是尋找到新的靶點，對其進行阻斷或增強其功能使其發揮抗腫瘤作用。吉非替尼(gefitinib)可通過減少由間充質干細胞分泌的CCL5的數量負性影響表皮生長因子受體酪氨酸激酶，抑制腫瘤細胞的生長，抑制血管生成因子的侵入和分泌[12]。而CCL5在胃癌中的作用研究相對較少。本文通過CCL5與腫瘤相關巨噬細胞的表面標志物CD68在胃癌組織中的表達及其相關性進行研究，期望為胃癌的靶向治療提供重要的理論依據。

腫瘤相關巨噬細胞(Tumor associated macroph-ages，TAM)是腫瘤間質免疫細胞的重要部分，可分泌多種細胞因子和趨化因子導致發生上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，即上皮細胞向間質細胞轉化，侵襲轉移能力增強[13]。研究發現，微環境中大量TAM有利于胃癌的生長并導致患者預后不良[14]。本研究結果與上述文獻一致，CD68的表達與胃癌組織大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期、遠處轉移呈正相關性，與年齡、性別無相關性。

CCL5即調節活化正常 T 細胞表達與分泌的趨化因子(Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)，是分子量為8 kD的小分子蛋白，主要由CD8+T 淋巴細胞及巨噬細胞分泌,能夠誘導白細胞向炎癥部位浸潤。RANTES 特異性受體包括 CCRl、CCR3、CCR4 和 CCR5。CCR1 和 CCR5 是高親和力受體[15]。CCL5通過其受體發揮作用，當兩者結合后激活G蛋白并最終引起細胞內鈣離子濃度上升及蛋白激酶C的活化，趨化白細胞、調節性T細胞、單核細胞的遷移和增殖，有研究顯示CCR5-CCL5軸與癌癥轉移密切相關，天然中藥DT-13通過CCR5-CCL5軸抑制胃癌細胞的轉移[16]，Yanagie等[17]在胃癌研究中對趨化因子受體不同的cDNA基因比較發現，趨化因子CCL5上調，其受體CCR5涉及到胃癌的擴散，其表達水平同樣可作為胃癌患者生存的一個不良因素，阻斷CCR5后胃癌患者的生存期明顯延長[18]。而在本研究中發現CCL5在胃癌組織中的表達與胃癌的大小、淋巴結轉移、組織浸潤、分化程度呈正相關性，與年齡、性別、遠處轉移無相關性，符合上述結果。

CD68是TAM的表面標志，本研究顯示CCL5與CD68的表達呈正相關，說明CCL5的分泌可能是TAM促進胃癌發生發展和轉移重要原因之一，該結論將為胃癌的治療提供新的治療靶點。在將來的動物試驗中將應用藥物下調或封閉CCL5的受體CCR5后觀察腫瘤的生長、轉移情況，為臨床提供理論依據。

綜上所述，CD68和 CCL5對胃癌組織的大小、浸潤程度、淋巴結轉移、腫瘤分化程度起重要的促進作用，這一結論與胃癌血清中CCL5濃度的檢測結果一致[11]。隨著分子生物學技術的發展，CCL5可能成為胃癌治療的新靶點，為胃癌的靶向治療提供生物學依據，為胃癌的治療提供新的手段。

參考文獻：

[1]Mukhtar RA,Nseyo O,Campbell MJ,etal.Tumor-associated macrophage in breast cancer as potential biomarkers for new treatments and diagnostics [J].Expert Rev Mol Diagn,2011,11(1):91-100.

[2]Wang B,Xu D,Yu X,etal.Association of intra-tumoral infiltrating macrophages and regulatory T cells is an independent prognostic factor in gastric cancer after radical resection [J].Ann Surg Oncol,2011,18(9):2585-2593.

[3]Wu H,Xu JB,He YL,etal.Tumor-associated macrophages promote angiogenesis and lymphangiogenesis of gastric cancer [J].Surg Oncol,2012,106(4):462-468.

[4]Soria G,Ben-Baruch A.The inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 in breast cancer [J].Cancer Lett,2008,267(2):271-285.

[5]Vallet S,Pozzi S,Patel K,etal.A novel role for CCL3 in myeloma-induced bone disease via osteocalcin downregulation and inhibition of osteoblast function[J].Leukemia,2011,25(7):1174-1181.

[6]Dairaghi DJ,Oyajobi BO,Gupta A,etal.CCR1 blockade reduces tumor burden and osteolysis in vivo in a mouse model of myeloma bone disease[J].Blood,2012,120(7):1449-1457.

[7]Lv D,Zhang Y,Kim HJ,etal.CCL5 as a potential immunotherapeutic target in triple-negative breast cancer [J].Cell Mol Immunol,2013,10(4):303-310.

[8]Lin S,Wan S,Sun L,etal.Chemokine C-C motif receptor 5 and C-C motif ligand 5 promote cancer cell migration under hypoxia [J].Cancer Sci,2012,103(5):904-912.

[9]Zhang Y,Lv D,Kim HJ,etal.A novel role of hematopoietic CCL5 in promoting triple-negative mammary tumor progression by regulating generation of myeloid-derived suppressor cells[J].Cell Res,2013,23(3):394-408.

[10]Sima AR,Sima HR,Rafatpanah H,etal.Serum chemokine ligand 5(CCL5/RANTES)level might be utilized as a predictive marker of tumor behavior and disease prognosis in patients with gastric adenocarcinoma[J].J Gastrointest Cancer,2014,45(4):476-480.

[11]Zhao ZJ,Zhang RP,Wang G,etal.Prognosis of patients with recurrence after curative resection of advanced gastric cancer[J].Chin J Gastrointest Surg,2011,14(2):107-110.

[12]Borghese C,Cattaruzza L,Pivetta E,etal.Gefitinib inhibits the cross-talk between mesenchymal stem cells and prostate cancer cells leading to tumor cell proliferation and inhibition of docetaxel activity[J].J Cell Biochem,2013,114(5):1135-1144.

[13]Galdiero MR,Garlanda C,Jaillon S,etal.Tumor associated macrophage and neutrophils in tumor progression[J].J Cell Physiol,2013,228(7):1404-1412.

[14]Zhang QW,Liu L,Gong CY,etal.Prognostic signicance of tumor-associated mac-rophages in solid tumor:a meta-analysis of the literature[J].PLoS One,2012,7(12):483-496.

[15]Sigrist S,Oberholzer J,Bohbot A,etal.Activation of human macrophages by allogeneic islets preparations:inhibition by AOP-RANTES and heparinoids[J].Immunology,2004,111(4):416-421.

[16]Lin Sen-Sen,Fan Wei,Sun Li,etal.The saponin DT-13 inhibits gastric cancer cell migration through down-regulation of CCR5-CCL5 axis[J].Chin J Nat Med,2014,12(11):833-840.

[17]Yanagie H,Hisa T,Ono M，etal.Chemokine and chemokine receptor related to cancer metastasis[J].Gan To Kagaku Ryoho,2010,37(11):2052-2057.

[18]Mencarelli A,Graziosi L,Renga B,etal.CCR5 antagonism by maraviroc reduces the potential for gastric cancer cell disse mination[J].Transl Oncol,2013,6(6):784-793.

[收稿2015-04-07修回2015-07-16]

(編輯張曉舟)

[關鍵詞]胃癌；TAM；CCL5

Expression and correlation of tumor-associated macrophages and CCL5 in ganstric cancer

DINGHai-Xia,ZHAOLian-Mei,SHANBao-En.DepartmentofInstituteofCancerResearch,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

[Abstract]Objective:To study the expression and correlation of tumor-associated macrophages(TAM) and CCL5 in ganstric cancer.Methods: 48 cases patients with completed clinical and pathological data of gastric cancer paraffin block specimens were selected.Cancer tissues and adjacent tissues were used as control,using SP immunohistochemical method to detect CD68 and CCL5 in gastric cancer tissues and adjacent tissues,and using the Spearman correlation statistics statistical methods for the correlation.Results: CD68 and CCL5 showed positive expression in gastric cancer tissue,significantly higher than those in the adjacent tissues(P<0.01),CD68 and CCL5 were related with gastric cancer invasion depth,lymph node metastasis,TNM stage and tumor differentiation(P<0.001).There was positive relation between the expression of CD68 and CCL5 in gastric cancer(P<0.01，r=0.759).Conclusion: CD68 and CCL5 played a driving role to the invasion and metastasis of gastric cancer occurrence,suggesting that the secretion CCL5 by TAM may promote the invasion and metastasis of gastric cancer.

[Key words]Ganstric cancer;Tumor associated macrophages(TAM);CCL5

作者簡介：丁海霞(1981年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事內分泌與免疫機制的研究。

通訊作者②。

中圖分類號R735.2
①本文為河北省自然科學基金資助項目(No.H2015206376)。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)01-0074-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.016