分離外周血單個核細胞的條件優化*

蔡敏敏，顧曉瓊，高　飛，邱先桃，陳小娟，劉　非，鄭　浩

(廣州市婦女兒童醫療中心檢驗科，廣東廣州 510623)

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·論著·

分離外周血單個核細胞的條件優化*

蔡敏敏，顧曉瓊△，高飛，邱先桃，陳小娟，劉非，鄭浩

(廣州市婦女兒童醫療中心檢驗科，廣東廣州 510623)

摘要:目的比較不同抗凝劑、離心力及離心時間對葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法分離單個核細胞的影響，優化實驗方案。方法取肝素、EDTA及2種抗凝劑混合后的3種不同抗凝血，采用Ficoll法進行分離，用血細胞分析儀進行分類和計數，計算回收率和純度；同時對EDTA抗凝血進行不同離心力及離心時間的處理，優化分離效果。結果EDTA組獲得PBMC回收率為(51.32±50.21)%，純度為(45.38±22.14)%；肝素組獲得PBMC回收率為(24.52±19.10)%，純度為(78.46±11.91)%；EDTA+肝素組獲得PBMC回收率為(56.32±24.30)%，純度為(80.27±12.44)%。經單因素方差分析，PBMC回收率方面，EDTA組與肝素組比較差異有統計學意義(P<0.05)，EDTA組回收率較高，而肝素+EDTA組與EDTA組回收率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；PBMC純度方面，EDTA組與肝素組比較差異有統計學意義(P<0.05)，肝素組PBMC純度較高，而肝素+EDTA組與肝素組比較，純度則差異無統計學意義(P>0.05)；PBMC存活率方面，肝素+EDTA組與肝素組、EDTA組比較，均差異無統計學意義(P>0.05)。對EDTA抗凝血進行單個核細胞分離實驗表明，在離心力為600×g(1 800 r/min)，離心時間為25 min時分離效果最佳。結論肝素+EDTA組回收率、純度與單種抗凝劑實驗組相比，結果差異無統計學意義(P>0.05)，故在實驗過程中可以混合兩種抗凝全血進行細胞分離。EDTA抗凝血在離心力為600 g(1 800 r/min)、離心時間為25 min時，分離單個核細胞效果最佳。

關鍵詞:單個核細胞;Ficoll連續密度梯度離心法;抗凝劑；分離效果

外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞，PBMC常用于細胞培養及藥物敏感試驗等臨床科研項目，故對于實驗室研究具有重要價值。隨著單個核細胞在先天免疫激活、獲得性免疫調節、人免疫缺陷病毒感染及自身免疫疾病等生理、病理過程中的作用被逐漸揭示，其生物學功能受到了越來越多的關注[1]。目前分離PBMC的方法很多，各有利弊[2-5],如分離的過程較繁瑣、耗材較多、細胞分層效果及分離率欠理想等,但主要的分離方法是葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法，相對于分離效果更好的Percoll非連續密度梯度離心法，Ficoll離心法由于價格實惠及操作簡便的原因顯得更為常用[6]。筆者通過研究EDTA抗凝血在不同離心力及離心時間作用下單個細胞核的分離，旨在摸索外周血單個核細胞最佳分離條件。與此同時鑒于某些疾病的全血標本取材不便，臨床標本的肝素全血量未能滿足單個核細胞的分離，通過探討其他抗凝全血單個核細胞的分離效果，以便擴展全血標本獲取途徑。

1材料與方法

1.1材料隨機抽取廣州市婦女兒童醫療中心珠江新城院區全血標本60例，按肝素、EDTA、EDTA+肝素混合抗凝血標本分為3個實驗組，每組20例，相互對照。時間要求為采血后3 h內，其性別、年齡、體質量等無特殊要求。

1.2儀器與試劑上海申力儀器公司HF sabl200生物安全柜，白洋離心機廠的BFX5-320型低速自動平衡離心機，美國sysmex-5000血細胞計數儀，以及4%臺盼藍染液、牛鮑計數板、人淋巴細胞分離液(天津灝洋LTS1077)、Hanks液和改良型5%小牛血清培養液。

1.3方法

1.3.1取EDTA抗凝、肝素抗凝、EDTA+肝素混合抗凝血各20例，共60例待測抗凝全血進行血常規檢測，記錄其單個核細胞總數。

1.3.2取新鮮(肝素、EDTA、EDTA+肝素混合抗凝血)抗凝全血2 mL，加入等量hanks液，充分混勻后，傾斜疊加于等量密度為1.077±0.001的Ficoll分離液，使兩者形成一個清晰的界面。500 r/min離心15 min后，用吸管吸出中層白色云霧狀細胞，加入含4 mL hanks液混勻1 500 r/min 10 min，重復洗滌2次。去上清液，于沉淀細胞加入改良型5%小牛血清PRMI-1640培養基2 mL，配成細胞懸液，混勻，吸取100 μL置于離心管中。

1.3.3取離心管中細胞血液進行血常規檢測，再次計數其單個核細胞總數，記錄其純度。

1.3.4上機后于離心管中加入100 μL 4%臺盼藍染液，混勻，靜置3 min后吸取10 μL加入牛鮑板上，于顯微鏡下計算4個大方格內活細胞率。死細胞可被染成深色，活細胞不著色。在顯微鏡下計數，得出活細胞的總數和死細胞的總數，計算出活細胞的比例：活細胞百分率=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%

1.3.5取EDTA抗凝血每組10例按照2.2、2.3步驟分離單個核細胞，但在離心時間固定20 min，將離心力調到1 000 r/min，計算各血型的活細胞比例。依次類推，將離心力分別調到1 400、1 800、2 000、2 300和2 500 r/min 重做上述實驗，同樣計算出活細胞比例。

1.3.6取EDTA抗凝血每組10例按照2.2、2.3步驟分離單個核細胞，但在離心力固定1 800 r/min，將離心時間調為10 min，計算各血型的活細胞比例。依次類推，將離心時間分別調為15、20、25、30和40 min，重做上述實驗，同樣計算出活細胞比例。

2結果

2.1不同抗凝劑分離單個核細胞回收率、純度、細胞存活率，見表1。

表1　　不同抗凝劑分離單個核細胞回收率、純度

由表1可見，回收率方面：EDTA組與肝素組比較差異有統計學意義(P<0.05)，EDTA組回收率較高，而肝素+EDTA組與EDTA組回收率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；純度方面：EDTA組與肝素組比較差異有統計學意義(P<0.05)，肝素組PBMC純度較高，而肝素+EDTA組與肝素組比較，純度則差異無統計學意義(P>0.05)；細胞存活率方面：EDTA+肝素組與肝素組、EDTA組比較，細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2不同離心力外周血單個核細胞分離結果在相同離心時間下(20 min)，不同離心力外周血單個核細胞分離后結果顯示，離心力為1 800 r/min時，EDTA抗凝血單個核細胞活細胞比率最高。

2.3不同離心時間外周血單個核細胞分離結果在最佳離心力1 800 r/min下，不同離心時間外周血單個核細胞分離后結果顯示，離心時間為25 min時，EDTA抗凝血單個核細胞活細胞比率最高。綜上結果表明，EDTA抗凝血中，在離心力為1 800 r /min，離心時間為25 min時，分離單個核細胞效果最佳。

3討論

分離PBMC是臨床科研的常規工作，Ficoll作為傳統分離單個核細胞的方法，通過不同顆粒之間存在沉降系數差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶，從而獲取目的細胞[7-8]。理想狀態下，Ficoll離心法獲取單個核細胞的得率為80%～90%，細胞純度90%以上。但實際操作中，由于實驗室設備、環境因素及實驗操作人員的原因，分離效果往往未能達到理想標準。同時，部分實驗室由于未能得到充足的血液樣品而導致實驗進展緩慢甚至停滯不前。

吳鵬等[5]的研究表明采用Hanks液作為沉淀細胞的稀釋液，離心結束后能在離心液體的上部形成一個界面清晰的細胞層露，因而使得分離效果明顯增強，故本研究采用的稀釋液為Hanks液。與此同時，本研究采用顧曉瓊等提出的Ficoll一步法分離獲得PMBC，回收率及純度方面較Ficoll兩步法分離效果顯著。關于PMBC回收率及純度方面，本實驗對肝素組、EDTA組以及兩者混合后的3組不同抗凝劑進

行了比較。由于肝素組標本為離心后標本，離心過程中細胞會有破裂，再經過多次的洗滌和分離后，細胞損失的較多，導致回收率不如EDTA組未離心的標本結果理想，但單個核細胞的純度比EDTA組高。而細胞存活率方面，3組單個核細胞的存活率無明顯差異，與傳統方法獲得的細胞存活率水平相當，均在90%以上。故肝素+EDTA混合組單個核細胞則無論從回收率、純度以及細胞存活率方面，都與單種抗凝劑結果無差異，故可將兩種不同抗凝劑的血互相混合，從而增加了分離單個核細胞的原始血量，提高了單個核細胞的產出，為下一步實驗提供了充分的準備，特別是對于嬰幼兒采血困難以及采血量不足具有現實意義。同時，分離過程簡單化、有利縮短工作時間、提高工作效率，也減少了耗材，降低了試驗成本。

本研究還探討了不同離心時間和離心力下單個核細胞的分離效果，發現單個核細胞的分離效果并不是單純隨著轉數增加，離心時間延長而分離效果越好。分離細胞時離心轉數過低或者離心時間太短，表現在中間層下的分層液中出現紅細胞所形成的紅色區，稱為紅細胞污染，導致分離效果不佳。而離心時間過長，單個核細胞又會損失過多，故分離時的轉速與時間要做出合理的調整。從實驗結果來看，筆者認為在離心力為1 800 r/min，離心時間為25 min時的離心條件，分層效果最好，細胞計數中細胞活力最好。

綜上所述，在獲取PBMC的回收率和純度時應根據實際工作和實驗室的條件來不斷摸索，選擇最佳分離方法。臨床大部分科研分離PBMC通常只采用肝素抗凝全血，而本實驗通過觀察不同抗凝劑的全血標本混合后采用Ficoll離心法進行單個核細胞的分離，達到增加分離PBMC時的血樣來源的目的，是具有現實意義的。

參考文獻

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Optimization of condition on peripheral blood mononuclear cells separation*

CaiMinmin,GuXiaoqiong△,GaoFei,QiuXiantao,ChenXiaojuan,LiuFei,ZhengHao

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangzhouMunicipalWomenandChildren′s

MedicalCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the influence of different anticoagulants,centrifugal force and the centrifugal time on separation of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) by the Ficoll density gradient centrifugation method,and to optimize the experimental scheme.MethodsThree different types of anticoagulation blood with heparin,EDTA and their mixture were separated by the Ficoll method.Then the sort and count were performed by using the blood cell analyzer.The recovery rate and purity were calculated;Meanwhile EDTA anticoagulation blood was treated by different centrifugal force and centrifugal time for optimizing the separation effect.ResultsThe recovery rate and purity of PBMC in the EDTA group was (51.32±50.21)% and (45.38±22.14)%;which in the heparin group were (24.52±19,10)% and (78.46±11.91)%;which in the EDTA plus heparin group were (56.32+24.30)% and (80.27+12.44)% respectively.The single factor variance analysis showed that the recovery rate of PBMC had statistically significant difference between the EDTA group and the heparin group (P<0.05),the EDTA group had higher recovery rate,but the recovery rate had no statistically significant difference between the heparin plus EDTA group and the heparin group (P>0.05);in the aspect of the purity of PBMC,there was statistical difference between the EDTA group and heparin group (P<0.05),the heparin group had higher PBMC purity,but the purity had no statistical difference between the heparin group and the heparin plus EDTA group (P>0.05);in the aspect of the survival rate of PBMC,there was no statistically significantly differences between the heparin group with the heparin plus EDTA group and the heparin group with the EDTA group (P>0.05).The mononuclear cell separation experiments in the EDTA anticoagulation blood showed that in the centrifugal force 600×g (1 800 r/min) and centrifugal time 25 min,the separation effect was optimal.ConclusionThe recovery rate and purity of PBMC in the heparin plus EDTA group have no statistical differences compared with those in the single anticoagulant group(P>0.05).Therefore,in the experiment process,the two kinds of anticoagulation blood could be mixed for conducting the cell separation.The effect of EDTA anticoagulation blood for separating mononuclear cells is optimal at the centrifugal force of 600×g (1 800 r/min) and the centrifugal time of 25 min.

Key words:mononuclear cell;ficoll continuous density gradient centrifugation method;anticoagulant;effect of separation

(收稿日期：2015-07-25)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)01-0001-03

*基金項目：廣東省自然科學基金資助項目(S2013010012520)；廣州市科技計劃資助項目(201510010159)。

作者簡介：蔡敏敏，女，檢驗技師，主要從事妊娠糖尿病研究。△通訊作者，E-mail：Guxiaoqiong@163.com。