納豆芽孢桿菌代謝產γ-聚谷氨酸液體發酵中試研究

陳衛鋒，秦 濤，劉成更，李文孝，馬 齊

（1.陜西省科學院酶工程研究所，陜西西安 710600；2.西北生物農業中心，陜西西安 710043）

納豆芽孢桿菌代謝產γ-聚谷氨酸液體發酵中試研究

陳衛鋒1，秦 濤1，劉成更1，李文孝1，馬 齊2

（1.陜西省科學院酶工程研究所，陜西西安 710600；2.西北生物農業中心，陜西西安 710043）

以納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410為發酵菌株，在前期發酵條件基礎上，利用10 L發酵罐優化發酵培養基和供氧條件，再進行500 L發酵罐中試試驗，中試γ-聚谷氨酸最高產量達32.4 g/L。

γ-聚谷氨酸；發酵；中試生產

γ-聚谷氨酸（Poly γ-glutamic acid，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體以酰胺鍵形式縮合而成的一種氨基酸聚合物。γ-PGA具有可降解性、成膜性、保濕性、可食性等特點，在醫藥、環保、食品、化妝品及農業等領域具有廣闊的應用前景[1-3]。

γ-PGA可以通過化學合成[4]、天然產物提取以及微生物發酵而得，微生物發酵法[5]與前2種方法相比，不僅生產成本低，而且生產過程污染小，適合大規模生產，因此采用微生物發酵法生產聚谷氨酸成為目前研究方向的主流，現在絕大多數γ-PGA產品由利用芽孢桿菌[6]發酵、提取分離得到。

試驗以納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410為生產菌株，在搖瓶發酵產γ-PGA最佳培養基和培養條件及10 L發酵罐小試的基礎上，進行500 L發酵罐中試研究，確定其最適發酵工藝參數。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）HSF1410，由陜西師范大學食品工程與營養科學學院提供；葡萄糖、酵母粉、K2HPO4，NH4Cl，MgSO4，天津市科密歐化學試劑有限公司提供。

GRJB-10D型10 L發酵罐，鎮江格瑞生物工程有限公司產品；500 L發酵罐，陜西美樂設備有限公司產品；UV-2802SH型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司產品；NDJ-5型黏度測定儀，北京東西器材有限公司產品；S1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產品。

（1）液體種子培養基。液體LB培養基，pH值7.0，于121℃條件下蒸汽滅菌20 min。

（2）原發酵培養基。葡萄糖30 g/L，NH4Cl 4 g/L，L-谷氨酸鈉15 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO43 g/L，MgSO40.2 g/L，無水 CaCl20.2 g/L，pH值 7.0，于121℃下蒸汽滅菌20 min。

（3）優化培養基。用玉米淀粉經液化和糖化部分替代原發酵培養基中的葡萄糖，用玉米漿部分替代酵母粉，滅菌同原發酵培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 10 L發酵罐液體發酵條件的優化

（1）滅菌。采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時間20 min。

（2）接種。用氨水調節pH值至6.8左右，接入菌種，再調節pH值至7.0，接種量約為1%。

（3）培養。發酵溫度28℃，風量1∶0.5，壓強0.05 MPa，pH值7.0，發酵時間2 h，光密度0.35～0.50，可轉入發酵。

將納豆芽孢桿菌HSF1410接種于液體LB搖瓶種子培養基中，以轉速160 r/min，溫度37℃搖床培養18 h，即為種子液。按照2%的接種量接種至10 L發酵罐中，發酵培養基的裝液量為55%，通氣量為2 vvm，對發酵過程中的溫度、轉速及補料方式進行優化。整個發酵過程中，每4 h取1次樣，檢測發酵液中菌體生物量、聚谷氨酸合成酶活力、γ-PGA含量，以此確定最優的10 L罐發酵工藝。

1.2.2 500 L發酵罐液體發酵方法

（1）滅菌。采用高壓蒸汽滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時間20 min。

（2）接種。用氨水調節pH值至7.0左右，接種量約為2%。

（3）培養。發酵溫度37℃，通風量、罐壓和攪拌轉速根據溶氧的要求調節溶氧水平。補料分批發酵時，當殘糖含量低于20 g/L時補充糖液，以維持殘糖含量為10～20 g/L，發酵過程中每隔4 h取樣進行各種參數測定。

1.2.3 分析方法

（1）細胞生長測定。采用比濁法，以發酵培養基作為參比溶液，于波長600 nm處測定發酵液的吸光度（OD600）。

（2）發酵液中γ-PGA含量的檢測[7]。按照γ-PGA的凝膠滲透色譜（GPC）檢測方法分析各編號菌株發酵液中產物的濃度；采用GPC法，將發酵液稀釋25倍后過0.22 μm濾膜去除菌體，用1100Series型高效液相色譜儀進行分析；TSK-gelG5000PWxl-CP型色譜柱，10 μm，7.8 mm×30 mm（TOSOH，日本）；流動相：0.015 mol/L Na2HPO4-KH2PO4，0.15 mol/L NaCl溶液，pH值7.0；流速0.4 mL/min；檢測波長220 nm；γ-PGA標準品（Vedan，中國臺灣）。

（3）殘糖測定。采用改良裴林氏法[8]。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基配方優化

2.1.1 玉米淀粉添加量的優化

在前期搖瓶液化發酵得出發酵培養基配方確定葡萄糖濃度25 g/L，試驗采用玉米淀粉部分替代葡萄糖進行10 L發酵罐試驗。玉米淀粉按液化酶和糖化酶的使用說明經過酶水解，玉米淀粉與葡萄糖質量總計為20 g/L，玉米淀粉與葡萄糖按一定比例添加，按照接種量2%，發酵溫度37℃，發酵pH值7.0，通過分批次調節通風量、罐壓和攪拌轉速將溶氧控制在20%～25%，發酵52～54 h，測殘糖含量和γ-PGA產量。

玉米淀粉添加量對γ-PGA產量的影響見圖1。

圖1 玉米淀粉添加量對γ-PGA產量的影響

由圖1可知，隨著玉米淀粉添加量的增大，γ-PGA產量明顯減少。在玉米淀粉與葡萄糖添加比例在0.25時，γ-PGA產量降低不明顯，說明此發酵可以部分利用玉米淀粉水解的糖作為碳源。

玉米淀粉添加量對底物轉化率的影響見表1。

表1 玉米淀粉添加量對底物轉化率的影響

玉米淀粉水解后，在發酵液中也是葡萄糖，底物轉化率是指γ-PGA的合成量與玉米淀粉和葡萄糖之合的比值。由表1可知，隨著玉米淀粉添加比例提高，糖的底物轉化率也隨之下降，但是在玉米淀粉添加量為0.25 g時轉化率下降不明顯。更進一步證明，玉米淀粉可以部分替代葡萄糖作為碳源。

2.1.2 玉米漿添加量的確定

搖瓶發酵得出發酵培養基配方確定酵母粉2 g/L，試驗采用玉米漿部分替代酵母粉進行10 L發酵罐試驗。玉米漿與酵母粉按一定比例添加，接種量2%，發酵溫度37℃，發酵pH值7.0，通過分批次調節通風量、罐壓和攪拌轉速將溶氧控制在20%～25%，發酵52～54 h，測γ-PGA產量。

玉米漿添加量對γ-PGA產量的影響見圖2。

圖2 玉米漿添加量對γ-PGA產量的影響

由圖2可知，隨著玉米漿添加量的增大，γ-PGA產量明顯減少。在玉米漿與酵母粉添加比例為0.5時，γ-PGA產量降低不明顯，說明此發酵可以部分利用玉米漿替代酵母粉。

2.2 分批控制溶氧10 L罐小試

在已經確定的各項發酵參數條件下，在10 L發酵罐上進行溶氧控制的研究，分別調節通氣量、罐壓、攪拌轉速，分階段控制溶氧參數。在延滯期（0～6 h）控制20%溶氧，在對數生長期（6～20 h）控制45%溶氧，進入穩定期（20 h以后） 控制20%溶氧。

分段控制溶氧與恒定溶氧對生物量的影響見圖3。

圖3 分段控制溶氧與恒定溶氧對生物量的影響

由圖3可知，分段控制溶氧明顯能提升發酵液生物量，菌種生長總體水平有較大幅度提高。

2.3 500 L發酵中試

分段控制溶氧與恒定溶氧對γ-PGA產量的影響見圖4。

圖4 分段控制溶氧與恒定溶氧對γ-PGA產量的影響

由圖4可知，分段控制溶氧提高了γ-PGA的產量。

2.3 500 L罐中試放大

為了評價10 L罐發酵工藝的穩定性和可行性，在500 L罐中對發酵工藝進行放大試驗。

500 L中試發酵試驗見表2。

500 L罐中試產量在49～51 h達到最大，分別32.4，30.6，29.6 g/L，第3批次相對前2批次在接種時間上稍推遲，使得菌齡增長，但是仍未出對數生長期，導致菌種的生物量也相對前2批次增高，但

表2 500 L中試發酵試驗

[1]Bhatt R，De Vries P，Tulinsky J，et al.Synthesis and in vivo antitumor activity of poly（L-glutamic acid） conjugates of 20S-camptothecin[J].Journal of Medicinal Chemistry，2003，46（1）：190-193.

[2]Sun M H，Park C，Kim C J，et al.Natural and ediblebiopolymer poly γ-glutamic acid：synthesis，production，and applications[J].The Chemical Record，2005（6）：352-366.

[3]鞠蕾，馬霞.γ-聚谷氨酸的應用進展 [J].中國釀造，2011（9）：1-4.

[4]曹名鋒，金映虹，解慧，等.聚谷氨酸的微生物合成、相關基因及應用展望 [J].微生物學通報，2011，38（3）：388-395.

[5]Yokoigawa K，Sato M，Soda K.Simple improvement in是在同樣的發酵條件下，最終γ-PGA產量減少，這說明菌種過度生長會對代謝產物累積量有影響。

500 L中試放大，γ-PGA累積量3批次平均值為30.5 g/L，相對于10 L罐γ-PGA平均產量25.8 g/L提高了18.2%，這可能是由于擴大發酵體積提高了發酵液的傳質效率，從而改善了微生物的生長環境，使得代謝物累積量增設。

3 結論

（1）在發酵過程中，用葡萄糖質量25%的玉米淀粉可以部分替代葡萄糖，用酵母粉質量50%的玉米漿可以部分替代酵母粉，這樣產業化發酵生產可以相對控制成本。

（2）在發酵過程中采用分段控氧的供氧工藝，即通過分別調節通氣量、罐壓、攪拌轉速，分階段控制溶氧參數，在延滯期（0～6 h） 控制為20%溶氧，在對數生長期（6～20 h）控制為45%溶氧，進入穩定期（20 h以后）控制為20%溶氧，可以有效地提高γ-PGA發酵累積量。

（3）將10 L罐發酵工藝放大到500 L罐，發酵結果代謝產物量明顯提升，證明了發酵工藝穩定可行，為γ-PGA的工業化生產奠定了基礎。目前，尚無報道中試或產業化為γ-PGA發酵工藝，試驗的發酵水平達到了產業化生產水平，具有良好的工業化前景。

freeze-tolerance of bakers'yeast with poly γ-glutamate[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2006（3）：215-219.

[6]程艷玲，趙玉娥，王海玉.生物降解型聚谷氨酸的研究進展 [J].北京聯合大學學報（自然科學版），2008（2）：45-49.

[7]呂瑩，郝紫徽，李虹.γ-聚谷氨酸的分離提純 [J].食品與發酵工業，2005，31（2）：133-134.

[8]梁金鐘，王風青．微生物發酵法合成高分子聚合物 γ-PGA的研究 [J].北京工商大學學報（自然科學版），2011，29（1）：24-29．◇

Pilot Scale Fermentation of γ-Poly Glutamic Acidby Bacillus Subtilis Natto HSF1410

CHEN Weifeng1，QIN Tao1，LIU Chenggeng1，LI Wenxiao1，MA Qi2
（1.Enzyme Engineering Research Institute of Shaanxi Academy of Sciences，Xi'an，Shaanxi 710600，China；
2.Nerthwest Bio-agriculture Ceuter，Xi'an，Shaanxi 710043，China）

Bacillus subtilis natto HSF1410 is taken as start strains for fermentation，on the basis of the early stage of the fermentation conditions，10 L fermentation tank is used to optimize the fermentation culture medium and oxygen supply conditions，then pilot production of poly γ-glutamic acid is carried out use 500 L fermentation tank，pilot γ-PGA maximum yield of 32.4 g/L.

γ-PGA；fermentation；pilot production

TQ922.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.031

1671-9646（2016）12b-0018-03

2016-10-12

陜西省科學院基礎應用項目支持（2011K-13）；陜西省農業科技創新項目支持（2011K02-03）。

陳衛鋒（1971— ），男，本科，助理研究員，研究方向為微生物菌種選育及發酵工程。